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分析方法选择的基本原则
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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分析方法选择的基本原则
  假如你想做一顿丰盛的晚餐,首先必须看一下食谱,然后检查一下你所需的东西是否齐全,如果少了配料还必须去商店购买,这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时,也必须按照一定的程序进行,首先你必须要有专门的仪器和试剂,然后有目的地选择分析方法,这样你才可能得到好的分析结果,避免走一些弯路。
 

 二:柱子的选择
  在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择,色谱分析人员面对几百种色谱柱,你从何入手呢?我采取的方法就是订阅 LCGC亚太版中Ron Majors 的“色谱柱观察”这一专栏,自1984(1)年以来,Ron Majors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。
  现在大部分液相色谱分析都是使用反相色谱柱,其中以C18 和C8柱最为流行。然而色谱分析并不是流行歌曲,这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下,使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子(如表一所示),但 C18和C8经常是最好的固定相,C18和C8柱两者之间并无明显的差别,但在我们实验室中以常使用的是C8柱。
  色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析,但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离,这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述,在以后的章节中将进一步阐述。
 

 表一:样品及分析方法
  样品的特性 分析方法及色谱柱
  大分子量 专用色谱柱、离子交换柱、 size-excusion色谱柱
  手性异构体 手性色谱柱
  其它异构体(位置、立方体) 正相色谱柱、没有改性的二氧化硅柱
  无机盐混合物 离子色谱分析
  碳水化合物(糖类) 反相氨基柱、离子交换法
  在过去的15年中,高纯度、低金属杂质含量的硅胶基质色谱柱是最为实用的色谱柱之一。但传统色谱分析用的硅胶颗粒具有差异性及酸性表面,固定在柱子表面后,导致出现拖尾峰,而且柱与柱之间的重现性较差(2.3)。最近硅胶基质中出现一种新的产品,这种硅胶具有Metal-free 特性,因此柱子性能更稳定,重现性也更好,分离后峰的形状也很不错。这种改性后的硅胶称为B型硅胶。由于具有上述优点,大多数色谱制造商都用不同的名称来表明它们与传统的产品之间的不同,如Intertsil (日本)、 BDS(USA)、YMC--Base(USA)等等。大多数色谱柱制造商都生产以B型硅胶为基质的色谱柱,因此你可以选择你所喜欢的供应商提供的产品。由于这种产品具有上述特性,建议使用A型硅胶柱的改为使用B硅胶柱。
 

 三:柱子尺寸规格的选择
  液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径(dp)的选择。最常用颗粒直径为5μm,但颗粒的直径(dp)为3.0及3.5μm的也适合分析使用,但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为5μm的色谱柱,因为这种色谱柱具有很长的使用历吏。颗粒的dp小意味着可以获得较高的理论塔板数,但所需的柱压增大,而且dp 为3.0μm的色谱柱易堵塞,所以一些色谱制造商又生产出dp 为3.5μm的色谱柱。
  在我们实验室中经常使用的是150mm×4.6mm,dp为5μm的色谱柱。另一种可以选择的色谱柱为75mm×4.6mm,dp为3.5μm的柱子,这种柱子的分离效果与前一种色谱柱分离效果相似,但使用时间减小一半。这两种柱子还有一个优点就是在合理的压力下(<2000psi ),流速可以设定在1.5--2.0ml/min之间,而流速高意味着可以缩短分析时间。
  有些分析者建议使用30 or50mm长的柱子作为前处理柱,但这种柱子不能提供足够的塔板数。另一种意见是使用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(≤1mmid),这两种柱子所需的溶剂少,但是这两种柱子所需的某些仪器与正常使用的色谱仪有些不同,而且正处在一个研究阶段,建议等这两种色谱柱研究成熟之后再使用。
  150mm×4.6mm,dp为5μm的色谱柱最为常用,75mm×4.6mm,dp为3.5μm的色谱柱也中较常见,在一般情况下流速可设定为1.5ml/min。

 

四:有机相的选择
  获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择,如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择,甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点,但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适,所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。
  在我的实验室中多数工作分析药物中的成份,其中有些样品的紫外吸收很弱,所以分析时紫外检测器的波长为220nm甚至更低,但是四氢呋喃的紫外吸收比较强,所以在波长低于240nm时,就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用,但是在低于220nm时,甲醇的浓度不易控制。选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用,而四氢呋喃易分解,形成过氧化物,所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现,在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题(4),但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长,而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比,甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下,流速可控制在1-2ml/min之间。
  考虑到理想溶剂的特点,如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用,而且使用方便,所以首选的有机溶剂应是乙腈,当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。
  

五:水相的选择
  假如样品为一般化合物,可以用水作为水相,然而离子化合物在药物分析时普遍存在,而这类化合物需要控制PH值才能得到很好的分离。如流动相的PH值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时,当PH值低于3时,色谱柱一般还比较稳定,然而当PH值高于8时,就需要缓冲液,因为此PH值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH值的二氧化硅柱也比较常见,但是对高PH值物质的分离,很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。
  考虑到样品的特性及柱子的稳定,建议在分析PH值较高的物质时应使用缓冲液,2.5mM的磷酸盐缓冲液 (PH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪,那么就必须选择易挥发的缓冲液,尽管不如真正的缓冲液有用,但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能够满足PH值的控制要求。
 

 六:其它的因素
  在你选择液相色谱的分析方法时,必须考虑到其它的一些因素,比如温度。因为温度变化1度,保留时间将变化1-3%,所以温度控制十分重要,温度的变化还影响色谱柱的选择性,这会使你更积极地投入到温度选择中去。在分析时柱温一般比室温高一点(如35℃),因为此温易控制,而且在低压下有利于降低溶剂的粘度,从而降低柱压。有时你需要利用其它的一些方法,如在流动相中加入部分特殊的物质,不过我建议最好在你实在必须时才用这种方法,记住KISS原则(Keep it simple ,stupid),不要使你的流动相过分复杂!

HPLC中梯度的优化

 梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间,优化样品的分离度。有机相起始比例越小,样品保留时间越长,随着梯度的改变,样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间,优化样品的分离度。有机相起始比例越小,样品保留时间越长,随着梯度的改变,样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工艺,或者内嵌极性基团,耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在,极性较大,为了提高样品的分离度,尽量使用大比例的水做梯度的起始。对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出。

 

  对于水加0.1%磷酸的流动相,开始时可以采用95%的水做起始,以95%的有机相结束,注意根据实际情况在梯度最后用大比例的有机相冲洗几分钟,以保证把小极性的杂质洗脱下来,防止样品残留到下一针。梯度的斜率一般采用凹线型的先小后大,梯度变化先慢后快,在此基础上再对梯度进行优化。

 

  使用缓冲盐溶液的梯度水相起始比例一般要从10~20%开始,为了防止盐析出,在梯度最后避免用纯的有机相做冲洗,梯度斜率采用恒定的就可以,在此基础上根据方法运行的情况对梯度进行调整。

 

  一般一个API的样品采集的时间控制在40~50分钟左右,样品出峰在15~20分钟左右比较好,如果有极性非常小的杂质存在可以在最后加一段时间的大比例有机溶剂冲洗色谱柱,最后再设置10分钟左右的重新平衡时间。中间体和IPC的样品分析方法时间可以根据需要减半或者时间更短。

 

 

ODS与C18柱的对比解析

  我要评论>> C8和C18都是色谱填料的一种,C8代表该化合物由8个碳组成,c18同理。色谱柱填料的特点是标志色谱柱的重要方面,你常常会看到在C8或C18的前面,有些其他的名称,比如hypersil之类的,他们表示在C8或C18的基础上,进行了一些改进,因此更适合于某类特定化合物的C8和C18都是色谱填料的一种,C8代表该化合物由8个碳组成,c18同理。色谱柱填料的特点是标志色谱柱的重要方面,你常常会看到在C8或C18的前面,有些其他的名称,比如hypersil之类的,他们表示在C8或C18的基础上,进行了一些该进,因此更适合于某类特定化合物的分析。从表面上看,C18和C8的区别就是C18比C8少了10个碳原子,而我们要讨论的区别,就是差别这十个碳原子带来的。这反映了物质决定意识的基本哲学原理,呵呵。

 

  其实谈到色谱,必须要搞清楚的一个就是极性,因为色谱分离的一个重要原理就是“相似相容”。那我们就先谈谈极性。

 

  C8 和C18都是反相色谱柱的一种,适用于分析弱极性的物质,而C8在弱极性较强的一侧,C18在极性较弱的一侧。也就是说,C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质,C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的差别,但是差别并不是特别明显,一般能用C8分析的物质,在C18上也能分离。这是因为,后者比前者的保留特性更好一些,这似乎和色谱柱填料的结构关系更为密切。

 

  在让我们谈谈空间位阻的问题,也许由于C18比C8的碳链更长,因此带来更好的保留特性。因此C8就更适合分析大分子类的物质,比如一些球蛋白等,都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反,分子量较小的物质,经常用C18来进行分析和分离。

 

  另外,你还会经常在C18前面看到“ODS”的字样,ODS是英文octadecyl silane的所写,意思是十八(烷)基硅烷,是以硅胶为基质键合的C18填料,由于大部分的C18柱都是硅胶基质,因此有时你还会看到色谱柱上只标称二者之一。其中以ODS居多。有时你还会看到ODS-x,x是不同的数字,这个x虽然是数字,但是不同厂家的产品代表的含义不同,一般以含碳量区分,但这也不是绝对的。有时还可能看到RP-18或RP-8,RP-18和C18意义基本一致,但是不同的厂家有不同的规定。

 

  C8和C18虽然有这些差别,但是使用和维护的办法都是一样的。采用反相色谱柱的维护办法就可以了。

 

 

HPLC中填料选择

 1、反相(与离子对)方法 C18(十八烷基或ODS)----------- 普适性好;保留性强,用途广 C8(辛基) -----------与C18相似,但保留值稍小 C3,C4 -----------保留值小;大多用于肽类与蛋白质 C1【三甲基硅烷(TMS)】------保留值最小;最不稳定苯基,苯乙1、反相(与离子对)方法

C18(十八烷基或ODS)----------- 普适性好;保留性强,用途广

C8(辛基) -----------与C18相似,但保留值稍小

C3,C4 -----------保留值小;大多用于肽类与蛋白质

C1【三甲基硅烷(TMS)】------保留值最小;最不稳定

苯基,苯乙基 -----------保留值适中;选择性有所不同

CN(氰基) -----------保留值适中;正相和反相均可使用

NH2(氨基) -----------保留性弱;用于烃类;欠稳定

聚苯乙烯基b -----------在1<PH<13的流动相中稳定;对某些分 离峰形好,柱子寿命长

 

2、正相方法

CN(氰基) -----------普适性好;极性适中;用途广

OH(二醇基) -----------极性大于CN

NH2(氨基) -----------极性大,欠稳定

硅胶b ------------普适性好;价廉;操作欠方便;用于制备LC

 

3、空间排阻方法

硅胶b -----------普适性极好;作吸附剂用

硅烷化硅胶 -----------吸附性弱,溶剂兼容性好;适用于有机溶剂

OH(二醇基) ------------欠稳定;在水SEC中使用(凝胶过滤)

聚苯乙烯基b ------------广泛用于有机SEC(凝胶渗透);一般与水和极性大的有机溶剂不相容

 

4、离子交换方法

键合相 ------------稳定性与重现性均不好

聚苯乙烯基b -------------柱效不高;稳定;重现性好

 

a :除另有说明,均为硅胶基质键合相

b :此类填料为非键合相

 

另,在最佳的测试条件下,填充良好的HPLC色谱柱应具备的理论塔板数

微粒直径(um)----柱长(cm)---------塔板数N

10 ------------------------15 ------------- -----6000-7000

10------------ ------------25 -------------------8000-10000

5---------------------------10-------------------7000-9000

5---------------------------15 ------------------10000-12000

5 ------------- -------------25-------------------17000-20000

3----------------------------5---------------------6000-7000

3---------------------------7.5-------------------9000-11000

3---------------------------10-------------------12000-14000

3---------------------------15-------------------17000-20000


 

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