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常用色谱和光谱分析方法和技术
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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常用色谱和光谱分析方法和技术

  色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术,构成了药物分析学科领域中最主要和最基本的研究手段和方法,应用日趋广泛,发展十分迅速,新颖方法层出不穷。
新近常用的色谱分析方法:
一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC) 又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC),是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊(或称胶束,微胞等)浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个(一般为25~160个)表面活性剂单体分子组成,其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内,胶囊溶液的某些物理性质(如表面张力、电导等等)以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊;后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同,并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析,是一种安全、无毒、经济的优越技术。
(一)原理:胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中,分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用;同时定量地指出分离组分的容量因子k'的倒数值与胶囊浓度成正比,一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。
(二)方法特点:与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系,而常规流动相是一种均相体系。特点:
1、高度的选择性:因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用,只要通过流动相中胶囊浓度的改变,就可使分离选择性获得改善和提高。此外,通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。    
2、便于梯度洗脱:由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时,溶液中仅胶囊的浓度发生改变,而表面活性剂单体分子的浓度不变,不影响流动相与固定相的平衡过程,因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间,并减少了流动相的消耗,适用于常规。   
3、提高检测灵敏度:胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度,从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。    
4、因分离组分不易分出,故缺点是柱效低且不适于制备分离。
(三)常用表面活性剂:常用的阳离子表面活性剂主要有:溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyl trimethyl ammonium bromide or chloride,CTMAD或CTMAC);阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS);非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。

二、手性分离色谱(Chiral Separation Chromatography,CSC)
是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异,有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。
(一)原理和方法:对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外,其理化性质是完全相同的,因而难以分离。传统方法(分步结晶法、酶消化法等)有很大局限性,特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后,TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物,且需要较复杂的样品处理步骤,制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。
  HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径:间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
 间接方法主要基于外消旋体混合物经柱前衍生化形成一对非对映异构体(Diastereoisomers)。此法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型对映体的物理性质完全相同,只能在手性固定相上才能获得拆分;如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物,其物理性质就有较大的差异,因而可在普通固定相(非手性固定相)上实现分离。本法需高光学纯度的手性衍生化试剂(Chiral Derivatization Reagent,CDR),衍生化反应往往比较繁琐费时;各对映体衍生化反应的速率有时也不相同。由于可采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测的灵敏度,以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点,柱前手性衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。    
 直接方法主要采用手性流动相添加剂(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可称为手性流动相(CMP)拆分法或手性洗脱法。它不必事先将样品制备成衍生物,而只须将手性剂加入流动相中。手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固,但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。常用的CMPA有:环糊精(Cyclodextrins)类(主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物);手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC),如(+)-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等;以及配位体交换型手性流动相添加剂(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC),其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物,再与二价金属离子形成螯合的配位化合物,以适当的浓度分布于流动相中,遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对,然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年来CSP法发展迅猛,应用日益广泛。它是不经转变成非对映体而直接拆分的方法,优点是:适用于不含活泼反应基团的化合物;除非必须衍生化,否则无需高光学纯度试剂;样品处理步骤简单。但迄今为止,CSP柱商品已有40多种,价格大多昂贵,尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。根据分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有:手性电荷迁移配位体固定相,如 Pirkle型HPLC-CSP;蛋白亲和配体固定相,如 Enantiopac(LKB);内部配位化合固定相,如环糊精(Cydobond)和纤维素酯(Chiracel)等;以及配基交换固定相,如L-脯氨酸-Cu2+共价键合于聚苯乙烯等基质上。
  CSP拆分对映体的理论概念:在HPLC的CSP柱上拆分对映体是利用药物对映体和特制的、在硅胶上键合的对映体固定相(CSP)之间所形成的非对映体复合物。由于非对映体复合物稳定性差异,可使两个对映体的保留时间不一致,与CSP形成稳定性较差的非对映体的药物对映体可先洗脱,因之实现了拆分。CSP设计是基于Dalgliesh在1952年提出的“三点手性识别模式”(Three-point chiral recognition model),认为要实现手性识别,在手性化合物分子与CSP之间至少同时要有三个相互作用部位,其中之一必受空间影响,或是相互吸引或是相互排斥。生成的非对映体的相对强度,决定了两个对映体的分离度和洗脱次序。
(二)三类手性分离方法的比较:CDR法的优点是应用条件相对简易,只需采用普通HPLC的固定相和流动相即可而且通过衍生化有利于增加检测(紫外或荧光)灵敏度;缺点是样品中相关化合物须预先分离、衍生化手性试剂的光学纯度的高要求以及异体对的衍生化反应速率不一。
  CMPA法的优点是不必作柱前手性衍生化;对固定相也无特殊要求;样品的非对映异构化络合具有可逆性而且利于制备。主要缺点是可拆分的化合物范围有限;某些添加剂不够稳定而且往往会干扰检测。
CSP法的优点较多,能广泛适用于各类化合物,适于常规及生物样品的分析测定,制备分离方便,定量分析的可靠性较高,采用此法研究考察的化合物已达数千种之多。缺点是样品有时也须作柱前衍生(但不一定是手性衍生化试剂),对样品结构有一定限制,其适用性尚不及普通HPLC固定相(包括正相和反相)那样广泛。

三、离子色谱(Ion Chromatography,IC)
  是由经典的离子交换色谱发展开创而成的新的液相色谱分析技术,具有快速、灵敏、选择性好、且可同时测定多组分的优点;还能测定无机的或亲水性的有机阴离子。IC已广泛用于其他多个领域,但在医药研究中的应用尚处起始阶段。它不仅可用于药品的常规质量同时分析,也可有效地用于生产过程的质量控制和体内药物分析,具有美好的应用前景。
(二)类型特点与原理:阳离子交换柱用于分离样品阳离子;阴离子交换柱用作分离样品阴离子。洗脱液为含有阳离子和阴离子的一种稀溶液,经泵输送入色谱柱后,其阳离子或阴离子最终将色谱柱中所有可交换的离子置换出来,同时由检测器转换为恒定的信号——基线。然后,进样少量样品,样品离子即被树脂柱所接受,并与等同数量的洗脱液离子交换。如果样品中所有离子的浓度大于洗脱液的离子浓度,那么在柱顶端的总离子浓度就将增加,这就产生了一个脉动,当它沿着柱移动并通过电导检测器时即得到一个正峰;反之,则获得负峰。进样后,洗脱液离子继续不断地经泵输入色谱柱,对树脂的可交换部位与样品离子进行竞争,并且使样品离子沿着柱子移动。由于样品离子对交换树脂有不同的亲和能力,因而不同的样品离子沿柱以不同的速度移动,最后完成了分离。 
 现代离子色谱的过程有所不同,主要有以下两种:
1、抑制型离子色谱法(Suppressed IC):由于离子交换分离的洗脱液几乎都是强电解质,其电导一般要较待测离子高二个数量级,簇会完全覆盖了待测离子的信号。为提高检测灵敏度,采用在分离柱后串联抑制柱的办法,可使洗脱液转变成低电导组分,以降低来自洗脱液的背景电导。另外可将样品离子转变成相应的酸或碱,以增加其电导。抑制装置有柱型和离子交换膜管型两种。
抑制柱内填充与分离柱填料相反电荷的离子交换树脂。当分析阴离子时,要用苯乙烯系列的强酸型(H+)树脂装柱;而分析阳离子时,则用苯乙烯系列的强碱型(OH-)树脂装柱。抑制柱须定期再生。   离子交换膜管型抑制系统可解决色谱上出现的水和碳酸离子的负峰。这是一种表面经磺化处理的聚苯乙烯多孔纤维管,管内流过流动相,管外流过再生抑制液,借助于离子交换作用来消除背景离子。
  分析阴离子时,Na+穿出纤维管壁进入抑制液(H2SO4)中,与硫酸反应生成硫酸钠而被除去;同时,H+穿入管壁,与流动相的Na2CO3反应生成H2CO3。若流动相为NaOH时,则生成水。但是,CO32-和SO42-不能穿过管壁,而阳离子却可穿过。在实际应用中,环境温度超过40℃时,H2SO4有可能将管膜破坏。为此有人改用十二烷基苯磺酸(Dodecyl Benzene Sulfonic Acid,DBS)作再生抑制液来取代硫酸液。DBS则较为安全,而且这种抑制液能使HCO3-减少而使负峰变得更小,并且通常都出现于同一位置,使色谱的重现性提高,保留时间不变;但会出现F-峰的峰高变低和峰宽增加的问题。有人在膜管内装填苯乙烯和二乙烯苯的共聚物小球,因而提高了交换效率和色谱峰的锐度,这种改良后的装置称为组合型多孔纤维管抑制器,可使负峰现象大大改善,其效果最好。
  对于阳离子来说,分离柱装有阳离子交换填料,抑制单元则为羟基阴离子交换剂,洗脱液中典型的是H+或苯二铵[Ph(NH3)22+],通过抑制单元后分别转变为H2O或Ph(NH2)。抑制型离子色谱柱因价格昂贵,使用也较复杂,限制了该装置和操作的进一步发展。
2、单柱离子色谱法(Single Column IC,SCIC):是一种不用抑制柱,直接用电导等检测器测定阴离子和阳离子的液相色谱法。特点是:采用足够低交换容量的分离柱,以及很稀浓度的洗脱液。    进行阴离子分析时,树脂的交换容量为0.005~0.10Meq/g,典型的洗脱液是1.0×10-4~4.0×10-4mol/L的苯甲酸、羟基苯甲酸或邻苯二甲酸的钠盐或钾盐,这些洗脱液都足够稀,从而使背景电导率相当低;大部分样品阴离子的当量电导比洗脱液阴离子要高,因此,样品浓度即使低至ppm级也能测得。采用羧酸页不是它的盐作为洗脱液时,对大部分离子的检测限可以扩大10倍。    进行阳离子分析时,采用低容量的阳离子交换柱,它能与电导检测器或者其它类型的检测器相连,一价阳离子的分离系数用稀硝酸溶液作为洗脱液和电导检测器,而分离二价阳离子时则用乙二胺盐溶液。二价过度金属阳离子可以用弱的络合试剂,如乙二胺酒石酸盐进行分离。在强络合离子(Fe3+和Al3+)的样品溶液中加入络合试剂(如EDTA或磺基水扬酸盐)能获得更好的先择性。由于各种碱金属离子的当量电导均比洗脱液中的H+的当量电导小,H+的极限当量电导为350mS/当量,而Li+、Na+、K+分别为39、50、74。同样,二价阳离子和过渡金属离子也较乙二胺盐阳离子的当量电导小,因此样品峰相对于洗脱液的背景电导要小而呈负峰。由于两者之间当量电导的差异是很大的,因此检测灵敏度很好,特别是用酸作为洗脱液时更是如此。
(三)离子色谱中最常用的检测器:IC中使用的检测器有:电导检测器、分光光度检测器、荧光检测器、折光率检测器、电化学检测器以及原子吸收或发射光谱检测器。
1、电导检测器:是IC中使用最广泛的检测器。其作用原理是用两个相对电极测量水溶液中离子型溶质的电导,由电导的变化测定洗脱液中被分离组分的浓度。此检测器的死体积小,若采用抑制电导法,IC体系通常可获得极低的背景电导,适于使用二极式电导检测器,其敏感度可达10-9g/l,线性动态范围达104;用SCIC体系时,洗脱液的背景电导常高达50ms/cm以上,极化效应严重,必须用五极式电导检测器或精心设计的二电极式电导检测器,其敏感度达10-9g/l,线性动态范围为103。    由于电导率大小与离子运动速度有关,温度升高将减少液体的粘度,从而加速了离子的运动,这样就会使电导率增加。通常,温度每升高一度,电导率将增加22.5%,因此需采用绝热恒重措施,以提高仪器对环境温度变化的适应性。
2、紫外-可见分光光度检测器:应用越来越受重视,特点:(1)选择性好;(2)通用性好;(3)敏感度好,市售检测器的噪声水平可低至210-6吸光度单位,其敏感度达10-10g/ml,因之很易进行ppb级浓度的离子分析;(4)线性动态范围达105;(5)与电导检测器相比,受温度影响较小等。

四、高分辨气相色谱(High Resolution Gas Chromatography,HRGC)简述
  HRGC在分离分析复杂有机化合物、天然产物、医药、环保等方面具有显著效果和特殊意义。与传统GC柱的主要差别在于HRGC柱是不装填充剂的空心柱,固定液相是涂渍或固定在柱管内壁上的。这种空心柱的渗透性很高,固定液量很少,这就使HRGC具有三大特点:分离效率高,一根20mm的色谱柱,总理论塔板数可达5万以上;分析时间短,与填充柱相比,可缩短若干倍;薄而均匀的固定液液膜,使柱流失的绝对量减少,因而信噪比得以提高。
(一)HRGC的色谱柱:最初使用的材料是不锈钢,操作方便,比较结实耐用,但对不少极性样品会有吸附并发生分解,成本也高,因而限制了它的应用范围。用玻璃作柱材料的螺旋形开管柱,可弥补不锈钢的一些不足,但易于破碎。熔融石英开管柱(Fused Silica Open Tubular Column,FSOT柱)对若干极性大、分子量也较大的药物也可不经衍生化而直接就能进行分离。开管柱(Open tubular column,Golay柱,空心柱)因柱管内径在0.2~0.8mm间,也称毛细管柱(Capillary column),但此名称不正确,因开管柱的主要特点不只是内径小,而是由于柱开口(即中空),因此通气性佳,无涡流扩散,可使用长柱,因而分离效率高,可称之为“高分辨”。此外,还有填充毛细管柱(Packed capillary column)和微填充柱(Micropacked column)它们的柱管内径也很小,严格讲,HRGC是指使用开管柱(包括涂壁开管柱和涂担体开管柱)的气相色谱法。
  常用的开管柱类型有:
  涂壁开管柱(Wall-coated open tubular column,WCOT柱):内径为0.05mm~0.53mm,内壁涂布固定相(SE30、OV-1、OV-225、Carbowax 20M等),相膜厚0.1mm~8.0mm。缺点是柱容量低,不适于在室温下分析分子量很低的成分和永久气体。涂担体开管柱(Support-coated open tubular column,SCOT):内装10-3~10-4mm的固体担体,厚度一般为0.1mm,样品处理量大。多孔层开管柱(Porous-layer open tubular column,PLOT柱):似SCOT,但常分两步制备,先是多孔层的沉积,然后再涂布固定相,多孔层常由重的晶性沉积或玻璃粉熔结而成。与SCOT相同,PLOT柱容量大而柱效较低。
  固定化相开管柱(Immoblilized phase open tubular column,IPOT柱):也称为不能提取相开管柱(Nonextractable phase open tubular column,NPOT柱):是在WCOT柱涂布后,将固定相进一步用横向交联或键合的办法,使之固化,形成更大、更稳定的大分子薄膜。此种柱可分为两大类:交联柱(crosslinking column)是在固定液相分子间进行共价连结;键合相柱(bonding phase column)是固定液相与支持物的表面连结。这两种开管柱比WCOT柱的优越之处在于:产生了稳定的涂层;得到了不可提取的涂层;使用温度往往要比未固化相柱的柱温上限约高30℃也可用作超临界流体色谱法或液相色谱法的固定相。
(二)开管柱的进样方式:由于柱系统特性不同(如内径、膜厚、样品容量、载气种类和线速度等)以及样品性质的差异(如组分的浓度范围、温度范围和稳定性等),需采用不同的进样方式和方法:
1、分流进样(Split injection):受柱容量限制,在分析很纯或浓度很高的样品时,对WCOT柱就须分流进样,即样品进入汽化室后被汽化样品按一定比例分成两部分,大部分放空,仅小部分进入色谱柱。入口分流器为最常用,优点是使用方便;缺点是不适于痕量分析和宽沸程样品。   
 2、无分流进样(Splitless injection):有两种形式:一种是直接无分流,全部样品在最短时间内完全汽化均匀混合后直接进入色谱柱。进样量能达1ml。迄今这种进样器为宽孔柱(内径0.33mm,膜厚0.5mm)和SCOT柱所广泛使用。
  另一种是Grob型分流(溶剂效应),注入的样品在汽化室中汽化,但在开管柱入口端再度冷却,以液体捕集,并保持冷却;然后快速加热色谱柱进行“再进样”。此法的优点是特别适用于痕量分析,对宽沸程样品也能获得满意结果。缺点是操作较难,必须利用溶剂效应或冷阱;溶剂的选择和起始柱温的限制;以及洗脱时间很严格、不能定量回收等等。   
 3、柱头进样(On-column injection):这是一种针对分流和无分流进样的缺点而设计的正在发展的进样方法。特点是:(1)必须使用外径为0.17~0.23mm的细针,而开管柱内径又必须是大约0.32mm的;(2)不能通过隔垫进样;(3)要缓慢进样,以免倒流;(4)对热敏感,稀的和宽沸程的样品比较理想;(5)能给出定量结果。    主要缺点是:样品中非挥发性物质在柱中积累,导致柱性变惰和柱效损失,为此,样品应经过仔细的预处理才可直接注入柱中,否则将缩短柱的寿命。
(三)开管柱的选择和性能评价:若供试品在填充柱上,经反复试验,对其组分的分辨率仍感不满意时;或要想使分析更加快速;或者,需要较好的色谱柱以克服样品峰的严重拖尾时;均可考虑选用开管柱进行分析。若缺少参考资料,可首先考虑样品组分的沸点和极性。一般,相差2℃或2℃以上的组分,采用非极性开管柱分离是合适的;若沸点相差在2℃以内,则需在极性较大的开管柱上进行分离为好。开管柱一般为柱长25m、内径0.25mm、膜厚0.25~0.4mm;但对低挥发性样品,则宜使用10m左右柱长、膜厚不大于0.2mm的开管柱为好。开管柱性能评价指标有:理论塔板数,容量因子,柱效率,涂渍情况,混合物的峰形以及峰的对称因子的大小等等。还可采用Grob标准试验混合物来进行综合性的进样考察。

五、多维气相色谱(Multidimensional GC,MDGC):
  
是用两根或更多的柱连接起来,以达到单柱不可能达到的分离分析结果。最简单的MDGC是2DGC,先将样品注入预柱(填充柱或开管柱),进行第一次分离。用中心切割(heartcut)选择所需的流分,使之进入分析柱通常用FOST柱进行第二次发离。两根柱可以在同一柱箱内或不同柱箱;切割用阀进行。所用预柱有:
1、高分辨柱:用于分离复杂混合物成为窄切割带,然后再由分析柱进一步分离;
2、高容量柱:用于分离溶剂、主成分、衍生化试剂,以保护分析柱和检测器。
3、样品预柱:用于除去样品中不需要的物质,只切割待分析组分进入分析柱。
4、浓集柱:用以从稀浓度的样品中进行样品富集。
  MDGC并不是一种新技术,近年来得到发展的原因是:
1、采用了FSOT柱,不仅高效、惰性,而且操作方便;
2、采用大口径、厚涂层的FSOT柱,样品载量大,可取代填充柱作预柱,而且惰性、分辨率较高,易于使用,而填充柱一般对痕量组分来说,活性太高。
3、有关硬件(如微量阀、低死体积柱切换装置)已经商品化。

六、常用的药物色谱分离的优化方法:
(一)色谱响应函数(Chromatographic Response Function,CRF)
:尽管CRF还不能帖切地全面地反映出实际效能,但作为一个色谱系统效能的尺度和寻求理想指标的起点,为色谱分离质量提供初步的数值性的描述,值得探讨。CRF最初是作为两相邻色谱峰的分离参数的函数:
按住 Ctrl+鼠标滚轮/中键 改变/还原图片大小 其中,ri是k对色谱峰中(k为峰总数减1)相邻峰间分离的尺度。后来扩展到实际分离参数(ri)和理论分离参数(r0)之间的比较以及实际分析时间(TL)和可接受的分析时间(TM)之间的比较:按住 Ctrl+鼠标滚轮/中键 改变/还原图片大小
式中,a为加权因子。有了CRF值,即可通过调节一组实验因子(如柱温、流速等)达到最好的响应。


(二)色谱优化函数(Chromatographic Optimization Function,COF)
:主要是CRF方程进行了改进,首先用峰的分辨率R(Resolution)代替峰分离参数(r),因为在色谱测量中两者相比更习惯于采用分辨率,而且当峰的分离参数r<0.75时,往往不太正常,这对非常难以分离的峰的优化是不利的。COF的定义如下:
按住 Ctrl+鼠标滚轮/中键 改变/还原图片大小 式中,Ri是第i对峰的分辨率,Rid是第i对峰的理想分辨率,Ai和B都是加权因子。当所有Ai和Rid都相同时,COF非常相似于CRF。但对于色谱峰的重叠或出峰次序因条件改变而倒置时,上述两种优化指标就不能适用。有待继续索。
(三)单纯形法(Simplex Methods):这是色谱分析最优化中常用的一种方法。就是在一定的空间中最简单的图形。如在二维空间,单纯形为三角形,任何其它图形都可分解为若干个三角形;在三维空间中,单纯形为四面体;n维空间的单纯形就是以n+1个顶点组成的图形。在二维空间中,不在一条直线上的三个点可构成一个单纯形。(见图)按住 Ctrl+鼠标滚轮/中键 改变/还原图片大小 在它的三个顶点G、H、L,按其中所处条件(X1,X2),求得相应的响应值(如CRF值)RG、RH、RL,然后进行比较。若其中RH最差,RG次之,RL最好,则可设想函数变化趋势。一般来说,“好点”在“差点”的对称位置的可能性较大。将G与L的中点F与H相连,沿HF方向延伸,使HF=FR而获得R点。R点称为H关于F的反射点,这种做法称为反射,R即为新的考察点。按R所处条件依法取得其响应值,若比G点的响应好,则丢弃H点而与G、L构成新的单纯形。若反射点R在新的单纯形中也是响应最差的点,则会反射至H点(称为“振荡”)。为此规定,在新的单纯形中寻求次差点的反射点构成新的单纯形。以后有人提出了改进单纯形法,除了“反射点”,还运用了“扩张”和“收缩”等规则。若RR比RL好,说明情况有了改善,可延伸得更远一点(“扩张”至S点)。若R点响应比G好,比L差,则以GLR为新的单纯形。若比G、L都差时,则“收缩”至U点。若R点比H点差时,则H“收缩”至T点。若HF方向上的所有点的响应值都比H点差,则将原单纯形LGH中的最佳点L作为中心,按一定比例收缩或扩张,产生新的单纯形。单纯形过程一直进行到满足给定的“收敛要求”为止。单纯形过程即可结束。

几种颇有应用潜力的光谱分析方法:
一、差示分光光度法(Difference Spectrophotometry):简称ΔA法。取两份相等的供试液,一份加酸,另一份加碱或缓冲液或其他能够发生某种化学反应的试剂,有时也可不加任何溶液,然后将两者分别稀释至同样浓度,一份置样品池中,另一份置参比池中,于适当波长处,测其吸收度的差值(ΔA值),在供试溶液的一定浓度范围内,ΔA值与浓度C之间呈线性关系。优点:在不同pH介质中,或经适当化学反应后,供试物发生了特征性的光谱变化,而赋形剂或其他共存物质不受pH条件或化学试剂的影响,未引起光谱变化,从而消除了它们的干扰。同时,参比池与样品池中含有相同浓度的供试物与干扰物,这就为吸收度的测量提供了一个近似理想的参比溶液。ΔA法主要有:
1、利用最大吸收波长进行药物的测定:紫外光谱对pH十分敏感时,可测得ΔA(碱-酸)或ΔA(pH7-酸)。
2、利用最大吸收与最小吸收之差(即振幅)进行药物测定:某些药物共存物在某pH范围内的光谱与pH无关(即吸收度不变)。而主药有最大和最小吸收,两者差值与主药浓度成正比。
3、利用干扰杂质等吸收波长进行测定:于干扰物的等吸收波长处进行测量,如测得供试物的相应吸收度,即可消除共存物的干扰。
4、利用最小吸收波长(lmin)处的增色效应进行测定:某些药物在碱性和酸性溶液中于处吸收重叠,但吸收值不同。但在碱性或酸性溶液中于lmaxlmin处可产生增色效应,利用此效应可测定药物浓度。

二、正交函数分光光度法(Orthogonal Function Spectrophotometry):在分光光度法中,任何一条吸收曲线,都可由一组正交多项式来描述它:
  f(x)=r0f0(l)+r1f1(l)+……+rkfk(l)
其中系数ri=Sfi(l)f(l)/si,     式中:si为归一化因数,fi(l)可从“正交多项式表”查得,f(l)为所选波长区间内等间隔的各点波长处的吸收度,N:为测式点数(须大于i+1)。N值越大,所得ri值越精确。
  ri是吸收度A的函数,ri∝C,则ri=AjCA ,Aj是常数,类似于经典分光光度法中的比吸收系数,数值上等于光路长为1cm、CA=1%(w/v)时的ri,常写作:ri(1%,1cm),取样品与对照品在同样条件下测N点吸收度,计算ri,根据式:ri测=ri(1%,1cm)×CA可求得CA
  在两组分混合液测定时,ri混=riA(1%,1cm)×CA+riB(1%,1cm)×CB,可适当选择其中的ri和波长区间,就可使riB×CB小到可以忽略不计,从而可以如同测定单一组分一样,由混合物的ri和对照品的ri(1%,1cm),求出混合物中组分A的含量;反之,同理也可测定组分B的含量。

三、近红外光谱分析法(Near intra-red spectrum,NIR)
  
波长范围800~2500nm(12500~4000cm-1),优点:
1、没有中红外光谱(Mid intra-red spectrum,MIR,4000~400cm-1)吸收带显示出的边缘干扰(fringe interference),故在一较大的吸收动态范围内这些吸收带强度与被测物浓度之间有线性关系;
2、和MIR不同,水分吸收不会覆盖C-H、N-H和O-H的吸收带,因此,NIRS(NIR Spectroscopy)可用于水溶液样品、含水固体和泥浆状样品的分析;
3、样品可不经溶剂稀释、制备溴化钾片等处理而可直接测定,免除样品制备时可能带入的误差,因而其定量效果优于GC、HPLC和FTIR等法。
  药典中原料药多用MIR作指纹分析,或以标准图谱核对,或与参比标准对照,所得光谱质量多取决于样品制备的准确性和重现性,而且操作繁琐、影响因素很多。NIRS法则方便得多,仅需将样品装入样品池内而不必作预处理。一般,液体样品可直接装入光路长1~30mm的石英池中。固体样品可直接放入具有石英窗的反射样品杯中;盖上弹簧压缩盖即可。在1分钟内即可完成装样;取出样品、清洗杯子的时间也不需1分钟。通常将样品杯置入NIR光谱仪内,每秒进行5次扫描;一般扫描50次求得平均值制得最后的光谱,继之将光谱数据进行加工以作数据的定量或定性的解释。通常一次NIR分析仅需2~3分钟。
(一)用于鉴别:目前常用的是借助于计算机辅助的光谱匹配法(Spectral matching),就是将供试药物的光谱和存贮于机内的参比光谱进行对比并计算出“匹配系数(Match index,M.I.)”。若M.I.越接近1.000,则这两个光谱越是匹配;而当M.I.接近于0.000时,则为极不匹配。有时会出现负值。
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式(1)中,X和Y是二个光谱的矢量表示(Vectorial representation); 式(2)中Xi是光谱A在波长i处的振幅(吸收度);Yi是光谱B在波长i处的振幅(吸收度)。矢量X和Y是由光谱A和B的N个波长处所得吸收度读数总和而得到(在某波长范围内每隔Mnm测一次吸收度,故有N个波长点)。在N维空间中这二个矢量具有不同的大小和方向。这二个矢量间可形成一个夹角(q),夹角的cosq即可确定M.I.。若q=0°,则cosq=1.000;若q为90°,则cosq=0.000,二矢量正交,完全不重叠。若q大于90°,则cosq为负值,这种情况有时会出现。
(二)用于纯度检查:较纯的样品的M.I.等于或接近于1,而纯度稍差的样品的M.I.距1尚有一定的差距。
(三)用于含量测定:NIR漫反射(NIR diffuse reflectance)吸收度(-lgR;R代表漫反射)与样品中待测组分浓度之间存在着一定的内在关系,样品i中某一组分的浓度yi可用这个样品在m个不同波长处的吸收度Xik(k=1、2、…、m)的线性组合来表示:按住 Ctrl+鼠标滚轮/中键 改变/还原图片大小
式中,F0为与仪器有关的校正常数;Fk(包括F1、F2、…、Fm)为在波长1、2、…、m处待测组分或基质的校正系数;数值为正时表示这一波长为组分的特征波长;为负时表示系基质的干扰波长,应将此值扣除。上式也可改写成具体公式:
组分%=F0+F1log(1/Rl1)+F2log(1/Rl2)+…+Fmlog(1/Rlm)
式中的校正常数(F0)和校正系数(Fk)通常是选用n个浓度已知的样品作为校正集(Calibration set),分别测得校正集样品在m个不同波长处的吸收度,再用多元线性回归(Multiple Linear Regression,MLR)或偏最小二乘(Partial Least Square,PLS)算法,借助于电子计算机进行数据处理以求出校正常数和系数,同时选择出校准的最佳波长,并获得各相应组分的校准公式,之后用于实际样品的测定,即得。校准公式一旦建立,实际测定时方法简易、快速、精确。

四、核磁共振光谱定量分析法(NMR):
(一)特点:

1、对于确定的核(质子),其信号强度与产生该信号的核(质子)的数目成正比,而与核的化学性质无关。
2、利用内标法或相对比较法,分析混合物中某一化合物时可无需该化合物的纯品作对照。
3、信号峰的宽度很窄,远小于各信号之间的化学位移的差值,因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。
4、方法简易快速、专属性高,可选择性地测定复方药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体;一般无需分离,且不破坏被测样品。
(二)定量分析方法:NMR图谱中,可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数;而共振峰面积或峰高是定量分析的依据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时,一般只对该化合物中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的峰面积进行比较,即可求出其绝对含量。当分析混合物时,也可采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较,然后求得相对含量。因此,在测量峰面积或峰高以前,必须了解化合物的各组成基团上质子所产生共振峰的相应位置,也就是它们的化学位移值(d值),并选择一个合适的峰作为分析测量峰。常用的NMR定量分析方法有:
1、内标法(绝对测量法):在样品溶液中,直接加入一定量内标物质后,进行NMR光谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰(即吸收峰)面积与由内标物质指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较,当样品与内标均经精密称重时,则样品的绝对重量(Wu)可由下式求得:Wu/Ws=Au·EWu/ As·EWs —— Wu=Ws·Au·EWu/ As·EWs 式中:Au为样品测得和峰面积(不少于5次测定的平均值);As为内标物测得的峰面积(不少于5次测定的平均值);EWu为样品在该化学位移处的质子当量;EWs为内标在该化学位移处的质子当量。若样品重为W,则百分含量=Wu/W ×100%
对内标物要求:(1)最好能产生单一的共振峰,在扫描的磁场区域中,参比共振峰与样品峰的位置至少有30Hz的间隔;(2)应溶于分析溶剂中;(3)应有尽可能小的质子当量(EWs);(4)不应与样品中任何组分相互作用。 常用的内标物有:苯或苯甲酸苄酯(在5.3ppm处,由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致),适用于非芳香化合物;马来酸,适用于非链烯型化合物。
2、相对测量法:当不能获得样品的纯品或合适的内标时,可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较,然后按下式计算样品与该杂质的相对百分含量:
样品的相对百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}×100%
式中,n1和n2是指定基团的质子数。 本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。
3、外标法:欲测样品中某一组分的含量,可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度的标准液,使样品液浓度在其范围内,然后进行NMR测定,由所得图谱中某一指定基团上质子引起的峰面积对浓度作图,即得标准品的校正曲线。在平行条件下,测定样品溶液组分指定基团上质子的峰面积,即可由校正曲线求得样品的浓度。
4、峰高或峰位测量法:结构相似的混合物样品(如互为异构体),由于其NMR峰分离效果不好,用峰面积定量法不能精确测定,误差较大,此时可考虑采用峰高测量法或峰位测量法。
(1)峰高测量法:是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比,各组分之间的峰高比只取决于样品的百分组成,而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时,先用异构体I和II的纯品配成溶液,再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知两异构体的吸收峰互不干扰;可测出各自峰高。两者摩尔数MI+MII=1,若两者的峰高为HI和HII,则:
  HI=MI×CI=(1-MII)CI ;HII=MII×CII ;两式中,CI和CII是异构体I和II的峰高系数,为已知,HI和HII可测得。据此可求得MI和MII
(2)峰位测量法:当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时,经质子快速交换后,原来两种组分基团的信号合并,在NMR光谱上得到单一信号,此峰的化学位移与两组分的摩尔分数有线性关系,因此,测出混合物的化学位移,可直接求出二组分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换,可用NMR法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa的化学位移(dm)可按下式计算:
  dm=db+(da-db)Xa 式中db和da为纯的游离胺及其盐的化学位移,Xa为盐的摩尔分数。以dm对Xa或Xb(游离胺的摩尔分数)作图,应呈直线关系。因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物,测得其dm并作出校正曲线后,再测得未知混合物的dm,即可由校正曲线求得Xa或Xb。

五、质谱及其联用技术:
(一)质谱(MS)法常用的离子化方式:
基本原理是将供试物分子经一定离子化方式,如电子轰击或其它离子化方式,一般是把分子中的电子打掉一个成为M+,继之裂解成一系列碎片离子,再通过磁场使不同质荷比(m/z)的正离子分离并记录其相对强度,绘出MS图。即可进行元素分析、分子量测定、分子式确定和分子结构的解析和推断等等。
1、电子轰击离子化(Electron Impact Ionization,IC):是最常用的一种,特点是可使分子引起相当大的碎裂,所得分子离子峰往往并不很强甚至不能识别。分子较大碎裂对供试药物的鉴定和结构解析是十分有利的;但对混合组分的分析和药物纯度检查是不利的。
2、化学离子化(Chemical Ionization,CI):是极为有用的一种,由于其谱形简单,能提供较强的准分子离子峰[Quasi-molecular,(M±H)+离子]和很少的碎片峰,因之,用于混合组分的分析和纯度检查是十分有利的。
3、场致离子化(Field Ionization,FI):非常适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺类药物均宜采用;此法也能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
4、场解吸离子化(Field Desorption Ionization,FD):扩大了MS的使用范围,此法可用于极性大、难气化以及对热不稳定的化合物,因而在生物活性组分、药物及其代谢产物或分解产物的研究分析工作中是一种非常重要而且十分有效的分析工具。
5、负离子化学离子化(Negative Ion CI,NICI):灵敏度较高,可以提高到fg(10-15)水平,只要供试药物本身或通过衍生化后具有高电子亲合能力者,就可选用此法,而且可给出特征的负离子峰。
6、快原子轰击(Fast Atomic Bombardment,FAB):是将样品溶解于低挥发性的液体基质中,用高速的中性粒子,如氩、氙等原子来轰击而解吸,因之称为快原子轰击离子化。特点:可直接进行分析,毋需做成衍生物;可适用于较大分子的MS分析,而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有机化合物的测定。如将FABMS与HPLC联用将成为适应力更强的分析手段之一。
7、激光解吸(Laser Desorption Inoization,LD):是新近发展起来的一种有效离子化技术,能量高、指向性强,因此具有其它能源难以达到的离子化成效,可获得很强的准分子离子峰。
在MS分析中,究竟选用哪一种离子化方式,主要取决于供试物的稳定性和挥发度。
(二)MS与分离步骤的联用:MS已具有较高的鉴识和解析有机化合物的能力;但是如将其与某些适当的分离步骤联用,则会更有效地解决分析鉴定的难题。主要联用方式有:
1、薄层色谱-质谱联用(TLC-MS):是一种最简单的联用技术,目前多以“脱机”(off-line)形式进行,即将TLC分离出来的组分洗脱或连同少量吸附剂一并直接向MS仪中进样。此法可用于混合药物的组分鉴定、纯度检查和药物稳定性试验以及其分解产物的鉴定。检测水平一般低于mg级。常采用TLC/EI-MS方式进行。
2、气相色谱-质谱联用(GC-MS):是当前最为活跃的联用技术,其检测限可达10-9~10-12g水平。目前多用高分辨气相色谱-质谱(HRGC-MS)联用;其质量分析器部分,除了通常的磁铁式单聚焦质谱仪外,还有双聚焦质谱仪。也有采用四极质谱仪的,而且可进行快速记录,受到广泛重视。一般,供试物经GC分离为单一组分,按其不同保留时间,与载气同时流出色谱柱,再经接口(Interface),进入MS仪,然后可通过EI或其它方法产生一定的MS图谱,由计算机自动检索核对,即可迅速鉴识样品。通常在规定条件下所得的MS碎片图及其相应的强度,犹如人的指纹图一样,易于辨识,方法专属、灵敏,一般可检知1mg/1g的样品,甚至检知水平更微。常用方法有:
(1)总离子流色谱法(Total Ionization Chromatography,TIC):是利用MS仪来记录色谱流出物的总离子流;这时,MS仪仅作为GC的检测器。因此,总离子流色谱图一般是与GC色谱图一致的。
(2)反复扫描法(Repetitive Scanning Method,RSM):在整个色谱分离过程中,MS仪可按一定间隔时间进行反复扫描,如每2~3秒扫描一次。在复杂的混合组分分析中,可得许多MS图谱,继之,用数据处理系统进行自动测量、记录和运算,最后根据GC图谱上的相应点,制得标准MS谱图。
(3)质量色谱法(Mass chromatography):将上述反复扫描所得并已储存在计算机中的MS图中重新画出一个或若干个碎片的洗脱过程图,因而也称之为重建离子流图(Reconstructed Ion Current Profile)。根据特征峰下的面积即可进行定量测定。优点是:即使分谱过程中分离很差或有峰重叠时,也能对测定物作出鉴定,并可于mg~pg范围内进行定量。
(4)质量碎片图谱法(Mass Fragmentography):也称多离子检测(Multiple Ion Detection,MID)或选择性离子监测Selected Ion Monitoring,SIM)。此法也是GC-MS测定中最重要的方法之一。系用保留时间为横坐标,记录一个或若干个特征离子碎片的强度所构成的质量碎片图谱,也就是进行选择性离子记录。此法可提高检测灵敏度2~3个数量级,达到pg水平。通过同时记录多个碎片及其相应的离子强度比,则可大大提高测定的专一性。测定时选用的信号离子碎片应具有特征性并尽可能有强的高峰。作成适当的衍生物往往会有利于碎片信号峰的产生。当采用四级质谱作为分析器时,由于它能进行快速的电场改变,因而可在谱的全程中任意选择几个碎片质量作成质量碎片图谱;而磁铁质谱仪仅能在峰的两侧的20%左右的质谱范围内选择其它信号峰。通过测量质量碎片图下的面积,即可进行定量分析。若以供试物的稳定同位素标记物作为内标,可用于人体上直接进行研究和测定,是十分理想的定量方法。此法大多已计算机化,整个过程十分快速而方便。
3、液相色谱-质谱联用(LC-MS):主要是HPLC-MS联用,由于接口技术的突破,HPLC-MS联用进入实用阶段。由于普通HPLC的洗脱速度约为1ml/min,这些流动相液体挥发成气体,将产生150~1200ml/min的气流。而正常真空状态的质谱仪仅能承受20ml/min的气体进入,若直接相连,质谱仪的真空系统会立即失效而无法工作。另外,HPLC常用于挥发性差、热不稳定化合物的分析,而经典MS离子化方法是将样品在真空条件下加热挥发成气体后进行离子化,两者联用时有可能发生样品热分解。CI、FAD等的使用,使发生热分解的问题得到解决。剩下的问题是找到理想的LC-MS接口,要求其应具有下列特征:
(1)对HPLC系统应无任何特殊要求,并能保证其效率;
(2)接口的死体积和时间常数要小;
(3)采用EI或CI等离子化方法时,样品不分解;
(4)采用接口后的LC-MS的稳定性和灵敏度应能与GC-MS相媲美;
(5)价格应较合理。但目前尚无一种能完全满足上述要求。常用的LC-MS接口有:传送带接口(Moving Belt Interface,MB)、直接液体进样 (Direct Liquid Introduction,DLI)、热喷射接口(Thermospray,TSP)、电喷射接口(Electrospray,ESP)、单分散气雾形成接口(Monodisperse Aerosol Generation Interface,MAGIC)等。
4、串联质谱(Tandem Mass Spectrometry,TMS):即MS-MS。将第一台MS作为分离器,第二台作为分析仪器来对混合组分直接进行分析。此法具有三种扫描方式。第一种是子扫描(Daughter scan),代表混合物中某一特定组分的离子,由MS1产生,输入MS2的反应区,即可得到一幅代表最初选定的特定离子的谱图,即MS-MS子谱。此方式广泛用于鉴定特定化合物,这种离子谱是由初始离子产生的,因而也就是它相应中性碎片的指纹谱。 第二种是母扫描,MS1扫描时,MS2保持恒定,得到可产生某一碎片离子的所有反应离子的谱图,即母谱。 第三种是中性丢失扫描,两个质谱仪同时扫描,可给出原始混合物中所有通过丢失一个特定的中性碎片的离子的分子量。这种中性碎片常常是某种官能团的特征。 和单级MS相比,此法能明显改善信号的信噪比,对测试样品的需要量也可大大减少。因之,此法特别适用于复杂混合物中痕量组分的鉴识。
(三)MS在药物分析中的应用:由于需样量少、检测限低。已广泛用于多个学科领域,尤其是药学学科。
1、用于药品的鉴定:依据是分子离子峰与其它特征峰以及它们之间的强度比。具有完全相同质谱的药物是十分罕见的,药物分子中的杂原子可产生一些适于鉴定的特征峰。
2、用于药品的纯度检查:若杂质分子量比药物分子量大,则很容量识别;若小,则只有当药物分子产生较少碎片,以及杂质的分子峰处于谱图的空位时才能检出。此外,杂质和药品间的挥发度比也是一个影响因素。若两者具有相同挥发度时,只有当杂质存在足够大的数量时才能被检出。
3、用于药品的定量分析:常以待测组分的特征峰峰强或面积对浓度作图,得出计算曲线,借以进行MS定量分析。为减少不同操作间的误差,往往需加入内标,以内标物对测定物信号的强度比和浓度作出计算曲线。
4、用于药物分解产物或代谢产物的研究:MS及其联用技术也可用于药物在温度、光线和机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢物的结构研究和量的变化。
5、用于混合药品或复杂组分的分析:这是最能展示MS及其联用技术才能的方面。既可借助于由混合组分的各自特征信号所组成的混合物MS图谱,也可与适当的分离手段联用后逐一鉴定之


 

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