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脂质体
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-2-22          ★★★【字体:

中国药学人才网 

编者按:
  
  脂质体是一种定向药物载体,属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中,这种微粒具有类细胞结构,进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能,并改变被包封药物的体内分布,使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄,从而提高药物的治疗指数,减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

  脂质体最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡,每层均为脂质的双分子层;囊泡中央和各层之间被水相隔开,双分子层厚度约为4纳米。后来,将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体。

  脂质体是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。这两种成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质,而且本身也具有极为重要的生理功能。

  用磷脂与胆固醇作脂质体的膜材时,必须先将类脂质溶于有机溶剂中配成溶液,然后蒸发除去有机溶剂,在器壁上形成均匀的类脂质薄膜,此薄膜是由磷脂与胆固醇混合分子相互间隔定向排列的双分子层所组成。

  按结构和粒径,脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体、含有表面活性剂的脂质体。按性能,脂质体可分为一般脂质体(包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等)、特殊性能脂质体、热敏脂质体、PH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按荷电性,脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。

 

目录

           第一课 一种新型脂质体——热敏脂质体

           第二课
靶敏感脂质体的研究进展

           第三课 脂质体的物理化学稳定性研究进展

           第四课 皮肤用脂质体的研究进展

           第五课 脂质体眼部给药系统的研究进展

           第六课
脂质体在生物学中的应用新进展

           第七课 脂质体在药剂学中的应用

 

第一课、一种新型脂质体——热敏脂质体

  脂质体是一种定向药物载体,属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中,这种微粒具有类细胞结构,进入人体内主要被网状内皮系统吞噬,从而激活机体的自身免疫功能,并改变被包封药物的体内分布,使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄,从而提高药物的治疗指数,减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体由双分子层组成,主要由磷脂为膜材及附加剂构成,其成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质,而且本身也具有极为重要的生理功能。按性能脂质体可分为一般脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、微波敏脂质体、声振波敏感脂质体、光敏感脂质体和磁性脂质体等。

  热敏脂质体的释药原理

  在研究的各种新型脂质体中,热敏脂质体(温度敏感脂质体)是一个很有发展前途的分支,它有效利用了脂质体和热疗的双重优势来提高治疗效果,降低毒副作用。

  在正常的体温下,脂质体膜呈致密排列的胶晶态,亲水性药物很难透过脂质体膜而扩散出来。当脂质体随血液循环经过被加热的靶器官时,局部的高温使磷脂分子运动加强,脂质体膜的结构发生变化,原来排列整齐致密的胶晶态磷脂双分子层在较高温度下变成疏松混乱的液晶态。脂质体在由凝胶态转变到液晶结构的相变温度(Tm)时,其磷脂的脂酰链紊乱度及活动度增加,膜的流动性也增大,这种结构的变化导致脂质体膜的通透性发生改变,脂质体内部包封的药物借助于跨膜浓度梯度而大量扩散到靶器官中,在靶部位形成较高的药物浓度,对周围的肿瘤细胞产生较强的杀伤作用,从而达到局部化疗的作用;而偏出相变温度时药物释放则缓慢。因此,根据这个原理用相变温度较低的类脂制备的脂质体,在未加热的器官中药物浓度比较低,对正常细胞产生的杀伤作用很小,使化疗药物所致的恶心、呕吐等副作用明显降低,减轻了病人的痛苦,增加了用药的顺应性;而当机体全身或局部温度升高到41~42℃时,就可以引起脂质体迅速释放内含药物,发挥药效。

  制备热敏脂质体的材料

  合成磷脂 一般以二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)为主,通过加入其他不同碳链长度的磷脂来调节脂质体膜的释放特性。例如,DPPC(Tm=41℃)通常与二棕榈酰磷脂酰甘油(DPOG)(Tm=41℃)按一定比例混合以得到不同的Tm。由于合成磷脂的纯度高,脂酰基的烃链长度基本一致,受热时分子运动规律相近,因此有比较固定的相变温度。但合成磷脂的制备工艺复杂,成本高,由此限制了热敏脂质体在临床上的推广应用。

  高分子聚合物 各国学者试图用廉价的合成高分子材料替代合成磷脂,制备具有热敏性的类脂泡囊,以降低成本,增加实用性。经体外试验证明,这类高分子类脂小囊具有良好的热敏性,但受到生物相容性和生物可降解性的限制。

  天然磷脂 天然磷脂也可作为制备热敏脂质体的材料,但是由于组成天然磷脂的脂酰基的烃链长短不一,形成脂质体时这些烃链容易互相嵌合,亦会排列成致密整齐的磷脂双分子膜,阻碍内水相中小分子物质的跨膜扩散。当脂质体周围环境的温度升高时,磷脂分子运动加速,各大小不一的烃链分子从整齐排列的脂质体膜中逃逸出来的临界温度不一,因此天然磷脂没有固定的相变温度,仅有一个较宽的“相变矩”。可以选择在脂质体膜中加入一些烃链长度适宜的合成高分子材料,改善脂质体膜的通透性,调节整体的相变温度,使热敏脂质体膜“相变矩”的最低点高于体温,以保证热敏脂质体的靶向释药。

  适于制备热敏脂质体的药物

  热敏脂质体主要借助于不同温度时脂质体膜结构的变化来调节药物的释放,油溶性药物的跨膜扩散受脂质体膜结构变化的影响较大,因而只有水溶性或两亲性药物才适合于制备热敏脂质体。同时最好选择适应证为能够进行热疗的各种肿瘤且对热稳定的药物来制备热敏脂质体。如果该药物与热疗有协同作用,则局部化疗与热疗结合,效果会更好。目前,受热疗设备及技术的限制,热疗主要用于消化道、呼吸道等自然腔道中的各种实体瘤和浅表瘤。

  热敏脂质体的评价

  如何评价脂质体的热敏性是研究过程中的一个关键问题。常用的评价方法有差示扫描量热法(DSC)和热敏释放百分率等。

  差示扫描量热法通过分析各样品中的DSC曲线来考察热敏脂质体被加热时相转变的情况,该结果可以对脂质体药物的释放随温度升高而增加的现象做出理论解释。而热敏释放百分率评价方法则是采用透析法或低压超滤、离心超滤等技术测定不同温度下脂质体的药物释放百分率来评价其热敏性的优劣。两者相比,后者更直观,且无需特殊设备。

  热敏脂质体的局限性

  热敏脂质体也存在着局限性:(1)热敏脂质体中的药物释放与粒径、膜材及药物等有关。大单层脂质体(LUV)、小单层脂质体(SUV)及多层脂质体(MLV)亦具有不同的相变温度。一般SUV的相变温度低,可能是高度弯曲的脂质双层张力较大的结果。(2)温度可以调节热敏脂质体的释药情况,但其靶向性较弱,难以躲避单核吞噬系统的作用。(3)局部高温虽可直接杀伤肿瘤细胞,但加热时间过长也可造成正常组织损伤。

  热敏脂质体有效地利用了肿瘤热疗的特点,巧妙地以温度作为靶向释药的导向,展现出广阔的发展前景和应用价值。

 

第二课、靶敏感脂质体的研究进展

王黎 侯新朴

  靶敏感脂质体(target-sensitive liposomes, TS-liposomes)是脂质体在与靶部位结合后能自动去稳定,将内容物释放出来。对于内吞能力比较弱或没有内吞能力的靶细胞来说,普通的免疫脂质体通常不能有效地释放药物。这时,靶敏感脂质体可能更有效,释放的药物通过跨膜转运进入靶细胞内。

  1 实现靶敏感的方法

  见图1。

图1 靶敏感脂质体去稳定的两种不同机制

图1 靶敏感脂质体去稳定的两种不同机制

  靶敏感脂质体在靶部位去稳定的两种可能的机制[1]为:①脂质体与一个多价靶结合后,配体侧向运动,在脂质体与靶的接触区聚集,造成脂质体表面上的配体由平均分布变为不平均分配,故而在脂质体膜上形成了非双层结构,引起内容物泄露,即“contact capping”效应;②结合于同一靶的脂质体,或与多个两价抗体结合的脂质体,相邻脂质体之间紧密接触,在接触区形成非双层结构,引起内容物泄露。

  2 磷脂分子的多形性

  两亲性磷脂分子分散于水中时,由于疏水效应而自动聚集,形成各种各样的相,不同动态分子形态(dynamic molecular shape)的脂质有不同的优势相(phase preference)。

  磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanol-amines, PE)头部小,而碳氢链所占面积比较大,呈正相的圆锥形,因而容易形成六角相(HⅡ相);并且PE的氨基与相邻PE分子的磷脂键形成分子间氢键,降低了PE分子的水化能力,进一步有利于HⅡ相的形成。

  PE的DSC图谱见图2。由图2看出,PE从双层结构向六角相转变(Lα→HⅡ)时只发生很小的焓变,而结构发生了巨大的重组,说明HⅡ中的酰基链与双层中的酰基链的混乱程度并无十分显着的差异。双层相与六角相之间相互转换的能垒很低,这就暗示了PE作为靶敏感脂质体主要脂质的可行性。

图2 PE的DSC图谱

图2 PE的DSC图谱

  加热和冷却速率为5℃/min,双箭头表示Lα→HⅡ的转变温度

  3 影响因素

  3.1 有效的头部面积 头部面积增加有利于形成双层结构。例如,二油酰磷脂酰胆碱(dioleoyl-phosphatidylcholine, DOPC)易于形成双层结构,而二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl-phosphatidylethanolamine, DOPE)易于形成六角相。

  3.2 静电斥力、氢键 由盐、二价阳离子、pH降低所引起的头部离子化,均有利于双层结构的形成。而分子间氢键则有利于六角相的形成。

  3.3 水化程度 去水化有利于HⅡ相。

  3.4 碳氢链长度及饱和度 降低碳氢链长度及饱和度有利于形成HⅡ相。如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) 由双层结构转变为六角相的相转变温度(TH)为101℃[2];DOPE有一顺式不饱和双键,TH为10℃[3]。

  3.5 温度 升高温度,碳氢链混乱程度增加,HⅡ相形成的可能性增加。

  3.6 双层结构稳定剂 带电荷的或高度可水化的两亲性分子均可作为双层结构的稳定剂。磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine, PS)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG)在含量高于20mol%时,均可稳定PE双层。这主要是由于它们降低了PE分子间的氢键,同时增加了界面水化度[4,5]。寡糖通过增加DOPE双层界面水化度、负电排斥及空间位阻防止双层之间的接触而稳定双层结构[6]。

  4 靶敏感脂质体的发展

  4.1 衍生化的抗体既作为双层结构的稳定剂,又作为寻靶的配体 早期研究[7]将抗简单疱疹病毒HSV糖蛋白gD的单抗用棕榈酸酯化(pIgG)后,稳定脂质体所需的最小浓度为pIgG: PE = 2.5×10-4 (mol/mol)。研究发现,抗体衍生化主要发生在Fc段(可结晶段,fragment crystallizable),而Fab段(抗原结合段,fragment of antigen binding)暴露在外,不但能被gD抗原识别结合,而且易于水化,从而稳定PE双层。pIgG在双层中能自由扩散,当抗原-抗体发生反应时,pIgG集中于抗原-脂质体的接触区,从而引起脂质体中的PE富集区去稳定,释放内容物,即所谓的“contact capping”效应。

  另外,有人用共振能量转换技术研究发现[8],脂质体去稳定的程度和表观速率强烈地依赖于脂质体的浓度。当脂质体浓度低时(0.1μmol/L),一个病毒子只去稳定1~2个脂质体;而高浓度时(1~10μmol/L),一个病毒子可结合34~104个脂质体,此时,一个病毒子上结合的脂质体双层之间相互接触,从而诱导HⅡ相的形成。

  这种早期的靶敏感脂质体稳定性较差,并且不是所有的单抗都有双层结构的稳定作用。

  4.2 酰基化的抗体只作为寻靶配体,带电荷的或可水化的双亲性分子作为双层结构稳定剂 研究发现[9],组成为80%DOPE,20%二油酰磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid, DOPA),0.06mol%磷脂化抗体的靶敏感脂质体可稳定长达30d,而免疫脂质体的特异性仍然保留,也就是只有HSV-1病毒子或病毒感染的细胞能诱导脂质体溶解。DOPA带负电荷,静电排斥而阻止双层之间的接触,因此有很强的稳定作用。

  这种改进的靶敏感脂质体的去稳定机制研究表明,免疫脂质体与靶部位的多价结合是至关重要的,而不一定需要contact capping效应,因为脂质体中包含有足够量的强效的双层结构稳定剂DOPA。因此脂质体溶解很可能是结合于同一靶的相邻脂质体紧密接触的结果,并且有实验结果证实了这一假设。首先, HSV-1病毒子或含有它的抗原决定簇的囊泡所引起免疫脂质体的溶解常常伴随着广泛的的脂质体的聚集;游离抗体或游离抗原决定簇抑制脂质体聚集后强烈抑制脂质体的溶解。其次,免疫脂质体溶解的表观活化能很大(5.46×104J/mol),这与纯PE的水化排斥力4.2×104~4.2×105J/mol[10]相一致,说明脂质体去稳定的限制步骤是结合于同一靶的相邻脂质体克服水化排斥力,而不是由双层结构转变为六角相结构。

  5 应用

  5.1 药物传输[11] 用包裹阿糖胞苷(ara-C)或阿昔洛韦(acyclovir,ACV)的靶敏感脂质体处理HSV感染的L929细胞,发现游离ACV的ED50为1.1μg/ml,当用靶敏感脂质体包裹后,ED50降为125ng/ml,并且非特异性细胞毒性降低了2个数量级;ara-C包入靶敏感脂质体后ED50约为1.8ng/ml,比游离药物低1000倍,而细胞毒性降低4个数量级。但是用PC代替PE后,ara-C的抗病毒活性降低了1.5个数量级,说明了脂质体中PE成分的重要性。

  5.2 免疫测定[7,12] 靶敏感脂质体包裹钙黄绿素(calcein)或碱性磷酸酶后与HSV孵育,引起脂质体去稳定、溶解,calcein荧光增强,碱性磷酸酶酶活性增加。用calcein荧光或酶活性可分别检测到7ml中5×104pfu和10ml中71pfu的HSV,而其它病毒不能引起溶解。预先用游离anti-HSV-gD处理HSV后,不再引起脂质体溶解,可以看出该方法的抗原特异性及高度灵敏性。与传统的ELISA相比,该方法简便省时,不需要多次的冲洗和孵育等步骤。

  与普通脂质体一样,靶敏感脂质体也存在血浆稳定的问题;脂质体与靶结合后,内容物释放于靶细胞外,因此传输的药物限于能被快速转入细胞内的小分子及能通过表面受体结合进入细胞内的大分子。
  众所周知,普通脂质体经聚乙二醇(PEG)修饰后,血中循环时间显著延长;但是,对于靶敏感脂质体,掺入PEG延长血循环时间的同时,是否影响其靶诱导的去稳定特性,还有待于进一步的研究[13]。

第三课、脂质体的物理化学稳定性研究进展

王长虹 孙殿甲

(乌鲁木齐 830028 新疆医学院第二附属医院药剂科;乌鲁木齐 830054 新疆医学院药学系)

  脂质体作为药物转运系统,满足了药物制剂治疗上的许多要求,具有许多优点。药物由脂质体携带后,能改变其体内的药动学行为,降低毒副作用和提高疗效。但应用程度受到其稳定性的限制。如果在体外药物从脂质体中迅速渗漏或在体内未到达靶组织之前脂质体渗漏,将大大限制其作为药物载体的应用。目前虽然制备方法有多种,但尚未制备出长时间在体内外均稳定的脂质体。笔者对近年来关于脂质体稳定性的研究进展作一概述。

  
1 脂质体的化学稳定性

  一般构成脂质体膜的主要成分为天然磷脂,其分子中均含有不饱和脂肪酸链,易氧化水解成过氧化物、丙二醛、脂肪酸及溶血卵磷脂等,后者可进一步水解成甘油磷酸复合物及脂肪酸等。卵磷脂的水解氧化可使膜的流动性降低,促进药物渗漏,因而滞留性变差,易产生聚集而沉淀,且产生毒性。

  1.1 脂质体的水解

  1.1.1 pH值对脂质体的影响 Grit等的研究表明卵磷脂、饱和大豆磷脂和磷脂酰甘油酯等的水解都受pH值的影响。这些磷脂成分均在pH 6.5时最稳定,水解速度常数最小。在实验条件下,磷脂酰甘油酯的水解速度比部分饱和的蛋黄卵磷脂的水解速度大。水解产物可以使脂质体混悬液的pH值下降,加速脂质体的进一步水解。因此,可在脂质体的混悬液中加入缓冲溶液,使pH稳定在脂质体最稳定的pH范围。

  1.1.2 温度对水解的影响 温度升高,加速磷脂的水解,水解速度常数与温度的关系符合Arrhenius方程。但直线在卵磷脂的相变温度(52 ℃)处发生断裂。低温下,磷脂膜呈胶态,水解反应需要较高的活化能。因此,可以在较低温度下贮存脂质体。

  1.1.3 缓冲液种类、浓度和离子强度对水解的影响 卵磷脂的水解主要受酸碱催化的影响。缓冲液的组成对水解反应亦有影响。三价枸橼酸根离子对卵磷脂水解的催化作用最强,而醋酸分子则起负催化作用。缓冲液对水解反应的催化与卵磷脂分子中的饱和程度无关。水解速度常数随缓冲液浓度的升高而增大。由于卵磷脂表面没有静电荷,离子强度对水解的影响不大。

  1.1.4 表面电荷对水解动力学的影响 在脂质体中加入带电荷的磷脂共同形成磷脂双分子层,可通过降低凝集和融合速率而改善脂质体的物理稳定性。加入蛋黄磷脂酰甘油(EPG)使表面电荷密度达0.065 C m-2时,在离子强度为0.1的混悬液中,脂质体的表面pH值(由表面电荷密度、本体pH、离子种类和离子强度计算)与本体pH值相差0.8个pH单位,使卵磷脂的水解速度常数与本体pH的关系发生改变。脂质体带电荷后,在酸性介质中,部分饱和的蛋黄卵磷脂和EPG的水解速度常数增加。而在碱性介质中则降低,可使脂质体在弱碱性条件下获最大稳定性。

  1.1.5 类脂组成对水解的影响 饱和大豆卵磷脂一般比天然大豆磷脂的水解速率小,尤其是在低温情况下(30 ℃~50 ℃)。因在低温下,饱和豆磷脂在脂质体混悬液中呈胶态。另外,饱和豆磷脂的水解需要较高的活化能。因此,对天然豆磷脂的不饱和脂肪酰链进行氢化,可使其水解变慢,稳定性增强。用饱和磷脂为成膜材料制备的脂质体的有效期在室温或低于室温条件下贮存,比天然磷脂脂质体的有效期延长。

  1.2 脂质体的氧化

  磷脂分子中都含有不饱和的酰基链,是其过氧化降解的薄弱环节。金属离子、光线及其它形式的辐射、某些有机分子、较高的pH值等均可加速类脂的自动氧化。然而,自动氧化可被金属螯合剂、抗氧剂如维生素E、丁基化羟基甲苯等抑制。

  维生素E是一有效的抗氧剂,被认为是通过与类脂过氧化自由基反应并猝灭单一态的氧分子和对类脂双分子层进行排序(如限制类脂层分子的流动性)等分子机制而发挥其抗氧化作用。维生素E分子中的羟基和磷脂分子中的脂肪酸酯羰基间可形成氢键。实验证明,在双分子层中加入0.1 mol的维生素E,磷脂的过氧化几乎被完全抑制,脂质体放置300 h释药80%,而由100%卵磷脂形成的脂质体在100 h时即释药100%。

  在脂质体双分子层中加入胆固醇使膜固化,可使自由基的生成减少,降低氧化水平,使稳定性显著增强。同时加入胆固醇和维生素E可发挥协同抗氧化作用,使蛋黄卵磷脂脂质体在低温无氧条件下长期稳定。在双分子层中加入硬脂胺和磷脂酸分别使膜带正、负电荷后,可使磷脂的氧化分别降低46%和65%。而且因带电后引起脂质体球相互排斥,提高了脂质体的包封率。

  姜黄素在脂质体膜中是一种光敏剂,也是自由基清除剂和金属离子络合剂。研究发现,姜黄素在脂质体磷脂的过氧化稳定方面具有双重作用。在光照时,姜黄素在膜中对氧自由基的形成起敏化作用,而且由于其络合Fe3+的能力不如EDTA。因此,光敏作用可被Fe3+催化。

  胶原蛋白、白蛋白、γ-球蛋白抗类脂的过氧化作用效果类似,均与其在膜中的量有关。在膜中有10-3 mmol的胶原蛋白时,即可使类脂过氧化降低而使脂质体稳定,不同温度下使过氧化作用降低约25%。三者浓度相同时的抗氧化作用分别是56%,45%和30%。蛋白质一般均有抗氧化作用,主要是因其可与脂肪酸和过氧化氢自由基相互作用。磷脂的过氧化随贮存温度的升高而增加,有胶原蛋白存在时也有同样效果。

  
2 脂质体的物理稳定性

  2.1 脂质体粒径的变化及其对稳定性的影响

  脂质体粒径的大小影响其在体内的稳定性。大的脂质体缺乏血管通透性,不能通过肝血管的细胞间隙,易被网状内皮系统吞噬,故在体内的半衰期较短。小于150 nm的脂质体可以减少肝、脾的摄取。单室脂质体(20 nm~50 nm)能增加靶部位的聚集和延长其在血液中的半衰期。Vemuri等研究了体外不同粒径的脂质体与高密度脂蛋白(HDL)的相互作用。结果表明HDL明显影响由蛋黄卵磷脂、蛋黄卵磷脂酰甘油酯和胆固醇组成的小粒径脂质体(0.25±0.09)μm的稳定性,而对大粒径脂质体的稳定性影响不显著。大粒径脂质体表现出多室脂质体的性质,呈现出紧密压缩的同心双分子层“葱头样”构造,当受到HDL攻击时,仅最外层的药物渗漏,而保护了内层药物不致于外漏。

  含有卵磷脂的脂质体的粒径在贮存期间发生改变,一般可在膜中加入带电荷的成分,如磷脂酰甘油、磷脂酸、硬脂胺等使粒径变化减小到最小程度。混悬液的离子强度对荷正电荷脂质体表面的Zata电位影响而使其大小发生变化,而对荷负电荷的脂质体粒径大小影响不大。

  2.2 脂质体相分离对其稳定性的影响

  当膜中的成分因发生化学降解反应,或者双分子层因温度变化发生相分离,应合理选择双分子层的组成加以克服。有时脂质体在体内与血浆成分结合发生相分离,使其稳定性受到破坏。

  2.3 包裹药物的外漏

  2.3.1 双分子层成分对外漏的影响 磷脂双分子层可发生相变和相分离。在相变温度以下时,膜结构处于晶态;在相变温度以上时,处于流体态和液晶态。当发生相变时,可有液态、液晶态和晶态共存,出现相分离现象,使膜的通透性增加,被包裹药物渗漏。

  由单纯一种磷脂构成的脂质体相变温度一致,稳定性较差。选用多种不同相变温度的磷脂混合构成脂质体,可使其稳定性增加。胆固醇对磷脂的相变具有双向调节作用。在相变温度以上时,它能抑制磷脂分子中脂肪酰链的旋转异构化运动,降低膜的流动性;在相变温度以下时,膜脂处于晶态排列,它又可诱发脂肪酰链的歪扭构象的产生,阻止晶态的出现。胆固醇分子中的羟基还可与磷脂分子中的羰基以氢键形成复合物。脂肪酰链自由运动的减少,引起膜的压缩,面积减小,结合紧密,流动性降低而使渗透性降低。

  双分子层中自由基的产生可加速磷脂的氧化,加入胆固醇可使膜固化,自由基的产生减少,降低氧化水平。双分子层中加入适量胆固醇可大大增加脂质体的稳定性,使磷脂的氧化降低。大量实验证明,当膜中胆固醇与磷脂的摩尔比为1∶1时,脂质体稳定性最好。

  胶原蛋白的抗氧化作用及因其带有正电荷而与卵磷脂间的静电作用使脂质体的稳定性增加,渗透性降低。在双分子层中加入0.1 mol的维生素E,胶原蛋白的抗氧化作用几乎被完全抑制,但其抗渗透作用仍然存在。实验证明,胶原蛋白的抗渗透作用的20%是由于其抗氧化作用,其余的80%则是基于其它的作用机制,如胶原蛋白使脂质体带正电,提高了荷负电荷药物羧基荧光黄(pH 7.4)的包封率和降低药物渗漏。

  2.3.2 包裹药物性质对其外漏的影响 药物脂质体的稳定性与所包裹药物性质密切相关。有人提出以辛醇/水的分配系数为指标,只有该值的对数lg poct>4.5的脂溶性药物或lg poct<-0.3的水溶性药物才能形成稳定的药物脂质体。对于具有中间值的药物包封于脂质体后,药物将迅速渗漏。已有实验表明脂溶性好或水溶性特别好的两类药物为脂质体包裹的最佳药物。脂溶性或水溶性都不好的药物,既不易包于脂质体内,且稳定性也差。

  2.3.3 外界环境对脂质体渗漏的影响 周围环境因素如温度、pH值、外力、胆盐等表面活性剂、冷冻融熔等均影响脂质体的稳定性。如脂质体在发生相变时,通透性增加。用相变温度较低的类脂制备脂质体,当机体全身或局部温度升高就可引起脂质体内容物渗漏。人们据此设计了热敏感脂质体。还有一种为pH敏感脂质体,当它处于低于某pH值时,由于发生化学降解等导致脂肪酸羧基的质子化而引起六方晶相的形成,进而导致药物迅速渗漏。

  超声振荡常用于制备单室脂质体。胆盐表面活性剂对脂质体结构的破坏也许是影响口服给药后药物载体活性的重要因素之一。脂质体对抗外界应力的能力依赖于类脂的组成(尤其是胆固醇)和囊的大小及表面电荷。研究表明,胆固醇含量在0.15 mol以内的增加对由超声振荡力引起的分解影响较小,胆酸钠对膜的分解作用则明显受到抑制。胆固醇含量在0.15 mol~0.33 mol范围内增加时,膜对超声振荡的稳定性显著增强。

  
3 提高脂质体稳定性的研究进展

  目前采用的冷冻干燥保存脂质体的研究及前体脂质体的制备有可能使之大量制备,长期保存成为商品。Payne提出了先制备前体脂质体,它为一干燥且具有良好流动性的颗粒,一旦加水水合,即可分散成等胀的多层脂质体混悬液,适用于静脉给药或用于其它给药途径。

  在脂质体中加入合适的防冻剂可降低脂质体在冷冻、融化和水合过程的破坏。防冻剂可减少脂质体囊中冰的形成以及冷冻和解冻过程中的渗透压应力。用于脂质体防冻剂的材料有甘油、二甲亚砜、糖类等。但至今仍无一种物质能防止水溶性药物从脂质体中的渗漏。Lloyd等对甜菜碱属物质的防冻性能进行了比较研究,结果发现甘氨酸甜菜碱及N-甲基化的甘氨酸甜菜碱等化合物浓度达0.6 mol时,可有效地降低脂质体在冷冻融化过程中药物的渗漏。并证明N-甲基化程度越高,防冻效果越好。而甜菜碱辛酯、乙酯等的防冻能力较差,并能增加药物从脂质体中渗漏。可能是由于甜菜碱的防冻机制主要是通过与双分子层中的水相相互作用促进玻璃态的形成有关。

  Okada对聚合脂质体作为口服药物转运系统进行了体外评价。他们用1,2-二(2,4-十八碳二烯酰基)卵磷脂为成膜材料,用盐酸偶氮异丁腈和盐酸偶氮-2-脒基丙烷为聚合诱导剂制备了聚合脂质体。将其与普通脂质体(饱和蛋黄卵磷脂-胆固醇,1∶1)在模拟胆盐的表面活性剂Triton X-100溶液中的稳定性进行了研究比较。结果聚合脂质体对Triton X-100的溶解作用具有完全的稳定作用。用14 C标记的牛血清蛋白和蔗糖的聚合脂质体在人工肠液和人工胃液中的释放率比普通脂质体低50%还多。聚合脂质体48 h在人工肠液和胃液中的释放率分别是25%和7%,而普通脂质体的释放率分别为70%和40%。说明聚合脂质体对胃肠道中的胆盐等表面活性剂具有很高的渗透稳定性。聚合脂质体口服后可到达胃肠道而保持原有结构并保留至少75%的活性成分。

  Ishiwata等用聚氧乙烯胆甾醇醚制备了聚乙二醇包裹的脂质体。虽然在体外小牛血清中其释放量随聚氧乙烯胆甾醇比例增大而增大,但由于脂质体表面包裹了一层亲水性的聚乙二醇膜形成的亲水性屏障以及聚乙二醇分子较大的空间位阻,可防止脂质体被血清蛋白识别而吞噬。给家兔静注后,聚乙二醇包裹的脂质体在血流中的滞留时间延长,并且在肝脾网状内皮系统中的积聚减少,增加了脂质体的体内稳定性和靶向性。

  Kronberg等在由双肉豆蔻卵磷脂、双肉豆蔻酰钠磷酸盐和胆固醇组成的脂质体中加入非离子型表面活性剂聚山梨酯80(4%)制备了立体稳定的脂质体。胆固醇可以防止脂质体粒子间相互碰撞时发生融合,聚山梨酯80分子可以防止脂质体的聚集而使其稳定。聚山梨酯80分子还可以防止脂质体与血清成分的相互作用而引起的破坏,延长脂质体在循环系统中的半衰期。聚山梨酯80分子不干扰双分子层类脂链的排列。而其它的非离子型表面活性剂如Triton X-100和泊洛沙姆(poloxamer)等则不然,易干扰双分子层的排列而使包裹药物外漏,降低脂质体的稳定性。

  总之,近年对脂质体的研究有很大进展,随着人们越来越深入地研究,必将有更多的稳定性好的脂质体投入临床。

第四课、皮肤用脂质体的研究进展

实习生: 丁明和 彭朝霞 (湖北医科大学药学系99届毕业生)

指导老师: 刘 辉 陈 鹰 (广州军区武汉总医院药剂科)

  60年代初期,Bangham在电镜下发现磷脂在水中形成脂质体(liposome)。1971年,Rymen等人开始将脂质体用作药物载体,由于其组成和结构的特点,脂质体用作药物的载体使药剂学的研究领域进入靶向给药的新天地,同时也更新了给药途径和护肤观念。

  脂质体是将药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状载体制剂[1]。脂质体类似细胞结构,有生物膜的特性和功能,它可以包裹水溶性和脂溶性两种类型的药物,是一种具有多功能的定向药物载体,能够降低药物毒副作用、提高生物利用度、并具有长效缓释作用。

  近年来脂质体局部给药引起人们的兴趣,已进行了系统性的研究并开发出不少适用于外用的药物剂型,现综述如下:

  
1 透皮吸收理论基础

  皮肤由表皮、真皮和皮下脂肪组织组成。完整的表皮组织有阻止物质透过皮肤的功能,一般认为表皮的角质层是限制化学物质向内、向外移动的主要屏障。

  扩散模型[2] 是长期以来用以说明药物经皮肤渗透的主要模型,即稳态时透皮速率满足Fick’s第一扩散定律Js=Ps·DCs,其中DCs为皮肤两侧的浓度差、Ps为渗透系数=Km·Dm/Hm, Hm为角质层厚度,Km为角质层与载体之间的分散系数,Dm为扩散系数,因而通过改变Ps和DCs均可改变透皮速率。

  药物透皮吸收及体内情况可假设为隔室模型来研究。当有载体时形成隔室模型,此时皮肤药浓远高于药物血浓,可以忽略药物的回扩散。当载体从皮肤上移去时,皮肤即可认为是一个简单的单隔室模型,但这种模型只用于参数预测而不用于参数估计。一个扩散模型中多个参数不同组合可能产生很多表面上很相似的药物动力学模式,而用同一隔室模型估计可能产生矛盾结果。对此,国外有人提出了有其共性的改进数理模型,骨架、皮肤角质层被认为是扩散层与一个包括表皮/真皮、血浆、周围组织的三室模型相关。
Kiyoshi等[2]通过对单层模型研究表明,单层模型在样品有较大变化时,预测药物动力学比扩散模型具有更大优越性。同时,William等[3]应用离子导入法研究利多卡因渗透皮肤的三隔室模型,该模型成功预测了3次治疗中每次隔室的模式和8h利多卡因的渗透情况。

  通过对透皮吸收理论基础方面的探讨,可以看出:皮肤用脂质体应最大量的使药物保留在皮肤中,尽量少的进入血液循环,研制此类制剂,我们应尽量做到使以脂质体为载体的药物被角质层吸收,在表皮和真皮内形成药物贮库,形成一个缓、控释模型,药物可持久地对病变细胞起到局部治疗作用,减少进入血流量,提高治疗指数,避免全身毒副作用。

  
2 皮肤用脂质体外用机理和实验临床研究

  2.1 皮肤用脂质体外用机理

  皮肤用脂质体用于局部对创伤或病变皮肤、粘膜起治疗和保护作用,既有利于药物与患处接触,在局部发挥药效,又可避免因吸收而产生的不良反应,同时有护肤、美容之功效。

  脂质体可以作为药物载体,并促进透皮吸收已被公认,但其作用机理尚未完全阐明,可以认为脂质体对皮肤有以下几种作用机制:(1) 水合机制 脂质体提供了外源性脂质双层膜,使角质细胞间结构改变,脂质双层中疏水性尾部排列紊乱,脂溶性药物可通过扩散和毛细管作用进入细胞间隙[4][5],使角质层湿化和水合作用加强,有人作过比较,用亲水性的磷脂与直径200nm左右的多室脂质体结合能力比较,发现后者为前者的5倍。(2) 穿透机制 作为转运药物的载体,完整的脂质体可以穿过角质细胞、角质细胞之间的间隙和皮肤附属管道开口进入皮肤,因脂质体大小组成不同,穿透皮肤浓度亦不一样,同时把药物带入的深度不一样[6]。R?ding等[7] 将不同浓度的脂质体涂布于猪背部脱毛皮肤上,分离研究表明,在皮肤中各层磷脂含量随脂质体浓度增高而增高,但当磷脂浓度大于1.0mg·cm-2时不再增高,其中分布于角质层中磷脂含量占99.5%。 Egbaria[8]通过类似实验证明,皮肤脂质所组成的脂质体作用优于磷脂脂质体。利用此特点我们可进行合理的处方设计。(3)融合机制 提供必须脂肪酸和类脂双层膜,脂质体磷脂与角质层脂质融合使角质层组成和结构改变,形成一种扁平的颗粒结构,通过脂质颗粒间隙,脂质体包封的药物便于进入皮肤,经由脂质交换、融合作用,维护皮肤生理功能[9]。Blume等[10]用核磁共振方法研究不同组分脂质体与皮肤角质层模拟物的相互作用,表明当加热到37℃放置2~24h,可观察到脂质互相混合,可能由于脂质分子单体通过水相交换,但也不排斥颗粒间的融合。

  2.2 皮肤用脂质体实验临床研究

  1979年,Gulaskharan[11]首次报道以脂质体包封药物用于透皮吸收,可使更多药物留在表皮到真皮之间,而使透皮吸收进入血液系统的药量减少,从而有效的避免了全身性不良反应。

  Holland等[12] 报告以冰折电镜法、小角X射线散射法和聚焦激光扫描显微镜法观察人体乳房和腹部皮肤与脂质体(包括人工合成不带电荷的脂质体niosome)在试管中相互作用,认为包封药物脂质体吸附和融合在皮肤表面,在脂质体混悬液的角质层界面间可产生药物的高度热力学活力梯度,这是脂溶性药物穿透皮肤脂质层的原动力。

  Masini等[13]在维A酸脂质体应用时发现0.01%维A酸脂质体经皮肤局部给药后生物利用度高于0.05%维A酸凝胶剂,且前者在靶组织中蓄积和贮存量增加而进入血液循环的药量减少,表明脂质体能增进维A酸的疗效,减少其毒副作用。

  临床研究表明,0.5%丁卡因脂质体给人完整皮肤封闭使用1h后,可产生4h局麻作用,较1%丁卡因乳膏更有效。

  Egbaria 等[14]报道,用体外扩散实验证实,皮肤用脂质所组成的脂质体比磷脂所组成的脂质体更能将药物输送到皮肤更深层,揭示脂质体与角质层两个双分子层达到分子水平的混合。同时也说明了与角质层类脂双分子层相似的皮肤脂质所组成的脂质体更能促进药物达到预期目的,表明脂质体双分子层结构是达到有效皮肤转运的必要条件。

  Artisan等[15]用市售豆磷脂作实验证实,分子量在2万~5万的单克隆抗体脂质体能很快进入皮肤深层,但不能穿透皮肤,而这种抗体的水溶液不能渗透皮肤。同时Jorosh等 [16]有关DNA修复酶脂质体应用于皮肤的研究也证实了这一点。说明水溶性药物脂质体也能很快地进入皮肤深层,高分子量物质可以以脂质体为载体透皮吸收。这对于生物大分子药物防治皮肤病具有重要意义。如生物蛋白T4N5 的脂质体定位于皮肤DNA修复,从而降低紫外线引起皮肤癌发生的可能性[18]。使用a-干扰素可治疗疱疹、生殖器疣等病毒性感染皮肤病,Hu等以甘油二月桂酸酯、胆固醇和聚氧乙烯-10-硬脂酸酯制备其脂质体,该脂质体能促进a-干扰素局部转运进入无毛小鼠皮肤活的表皮组织。

  Michelsan [17]通过研究证实,超氧化物歧化酶(SOD)本身不稳定,半衰期只有几分钟,用脂质体包封SOD后,稳定性增强,半衰期延长。在大白鼠机械性外伤和X射线引起皮肤损伤实验中,用SOD脂质体治疗,治愈时间缩短一半。

  Row等[19]以黄体酮脂质体治疗多毛症时发现,真皮层及皮下组织(毛囊处)中药物浓度较高,以益康唑脂质体进行体外试验,证明与传统制剂相比,表皮中有较高的药物浓度。Siciliao [20]综述了局部应用脂质体的制备方法和用途,强调指出,脂质体在皮肤病学和化妆品方面的良好前景。

  随着科技的发展,新型科学技术也应用到吸收促进药物转运中来。针对离子型药物及多肽类大分子的透皮吸收而应用的离子导入法,由于电场的作用,增强了水通过皮肤的转运从而增加非电解质药物的渗透,与使用皮肤渗透促进剂相比,离子导入法不引起皮肤的生理生化改变。而超声波法比离子导入法更能促进脂质体药物的吸收,时间更具时效性,脉冲式比连续式更有效,已有关于布洛芬此方面的报道[21] 。将皮肤反复(>100次)暴露在激光中,皮肤透过性将增加100倍以上,日前研究者认为,激光能更有效地促进药物转运。另外尚有放热法加强药物转运的报道,不过只在栓剂中研究较多。

  2.3 实验研究总结

  皮肤疾病大多位于毛囊、皮脂腺等活的表皮组织,如疱疹、皮炎、粉刺等,药物局部治疗成功的关键是药物必须透过角质层而达到病变部位,并维持一定时间。而脂质体作为局部用药载体,具有生物膜相似结构,与膏剂等相比具有更大的皮肤角质层透过量,减少药物进入血液循环,避免处方中使用氮酮等促透药增加药物血浓而带来的副作用[22]。同时,脂质体本身可生物降解,无毒性,不产生皮肤刺激性,是皮肤局部用药较理想的载体。

  同时,我们在进行脂质体研究特别是在处方设计时,应考虑到它的物理化学稳定性、组成、抗氧剂、络合剂、pH条件、所带电荷、缓冲液、亲水凝胶的种类与浓度等因素,使设计达到合理化,提高药物局部浓度,降低全身毒副作用。

 
 3 研究方向与展望

  3.1 研究方向

  皮肤用脂质体作为一种新制剂,尚有一些问题有待于进一步的解决,这些问题也是将来的重点研究对象,例如:

  (1) 对某些药物包封率不高,有人作过比较,SOD脂质体中单室脂质体包封率不到15%,多室脂质体包封率也不到50%,应根据实际情况选用合适的方法来制备。(2) 成品稳定性不好,经常出现渗漏情况,应研制出合适的抗氧剂、络合剂或对其组成比例进行适当而严格的调整。(3) 进一步将脂质体表面修饰成为主动靶向,通过对药物进行修饰,改造成合适的前体药物,改善药物的分配行为。(4) 皮肤用脂质体作用机理尚待进一步阐明,有助于更趋向合理化处方设计和用药。

  同时,脂质体的某些物理化学性质可根据治疗上的需要加以改变,例如其半径大小与给药途径及药物释放速度有关,通过渗入两性电荷物质可以改变其表面所带电荷对作膜材用的类脂成分的改变,可以控制药物的通透性和稳定性。

  3.2 展望

  脂质体用作皮肤局部用药载体二十年来,人们已经发现脂质体较普通制剂具有增强药效、延长作用时间、降低毒副作用等特点,根据已有的研究成果,开发靶向制剂是一个新趋向,皮肤用脂质体是其中一个方面。可以设想,不久的将来,在皮肤科领域中将有各种皮肤用脂质体制剂出现。

第五课、脂质体眼部给药系统的研究进展

吴 伟  陆 彬

  滴眼液给药,由于眼球运动和鼻泪系统的作用,使大量的药物损失,需每日多次给药,剂量不准确,眼内药物浓度波动大;混悬液或软膏给药又影响视力和眼球运动。为克服上述缺点,采用加入亲水凝胶卡波姆(carbomer)增加粘度,延缓药物的滞留时间,增加吸收;但容易使视力模糊,影响眼睑运动;或植入长效的控释给药系统,如Ocusert(毛果芸香碱控释膜),但患者有异物感。理想的眼部给药系统应能维持药物贮库,较长时间地释放药物;能有效地穿透角膜,到达眼内各用药部位;能降低原有药物的局部和全身毒副作用;制剂透明,不影响眼部的正常生理功能。

  脂质体作为眼部给药系统,其组成材料为磷酯双分子层膜,类似于生物膜,易与生物融合,促进药物对生物膜的穿透性,故药物外用滴眼的跨角膜转运效率较高;通过选择不同的制备方法,制成脂质体粒径为0.02~5μm之间,滴入眼部无异物感,不影响眼睛的正常生理功能。目前,脂质体眼部给药系统研究的热点主要集中在提高角膜对药物的穿透率,增大脂质体在角膜上的靶向性及粘着力,结膜下或眼球内注射治疗眼内疾患,以及携带单克隆抗体的靶向系统和基因眼内传递。

  1 外用滴眼和促进药物穿透角膜吸收

  脂质体包载药物后可以提高药物的眼部滞留时间和吸收量,碘苷脂质体较传统碘苷滴眼剂治疗效果明显增强[1]。新型免疫抑制剂FK506(环孢菌素A类似物)脂质体[2]给药2 h后,FK506在房水中浓度维持在5~28 ng/g,玻璃体内为12~22 ng/g,该浓度已超过治疗浓度;油溶液在角膜及结膜有最高浓度(200~1 200 μg/g),前后巩膜中也有大量存在,但房水及玻璃内较少(0.2~1 ng/g),表明脂质体较油溶液更易使FK506透入眼部组织。

  研究表明不同类型的脂质体促进脂/水溶性药物跨膜转运的效率不同。Schaeffer[3]和Singh[4,5]将脂溶性药物去炎松和水溶性药物氢化硫酸链霉素分别包封于大单室脂质体内,外用滴眼5 h后,眼内组织中去炎松的浓度为对照混悬液的2倍以上,但氢化硫酸链霉素的穿透性反而减弱。Stratfor[6]发现脂质体使肾上腺素的吸收降低,但菊糖却大大提高。脂质体跨膜转运效率除药物本身的脂/水溶性外还受其他因素的影响,如脂质体的大小、表面所带电荷及修饰基团、药物从脂质体中的释放速率、脂质体与角膜的粘着力及其物理、化学稳定性等。较一致的观点认为,延长含药脂质体在眼内的滞留时间,可提高药物的跨膜吸收。带正电荷的脂质体较易与负电荷丰富的角膜和结膜糖蛋白结合,可提高滞留时间与疗效[7]。Guo等[8]利用氨基酸分子与磷酯酰乙胺或胆固醇共价结合制成带正电荷的脂质体,与中性或带负电荷脂质体相比,带正电荷的脂质体显著地增加了角膜表面的滞留时间,且长短与电荷密度及磷脂双分子层的稳定性有关。Shiota等[9]将维生素A包封于用丙氨酸表面修饰的脂质体中,维生素A向眼部各组织的渗透被促进,而对照油溶液仅有极少量渗透到内部组织。脂质体与角膜的结合率有以下规律:带正电荷多室脂质体>带正电荷小单室脂质体>带负电荷小单室脂质体>中性多室脂质体和中性小单室脂质体。多室脂质体较其他类型的脂质体理想[10]。

  2 结膜下或玻璃体内注射

  结膜下或眼球内注射的药物由于局部浓度太高常会引起毒性,且维持药效时间短,需频繁注射,患者极痛苦。Liu等[11]于兔玻璃体内接种白色念珠菌72 h后,玻璃体内分别注射剂量为10 μg二性霉素B溶液,10、20、40 μg的二性霉素B脂质体溶液,右旋糖酐溶液和空白脂质体作对照。接种8周后,溶液组及20 μg脂质体组,玻璃体清晰,真菌感染得到控制,视网膜未受任何损伤;对照组及10 μg脂质体组真菌感染未得到控制,但40 μg脂质体组于光镜下检查发现视网膜损伤。

  增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)可造成视网膜牵拉性脱落而失明,Fishman等[12]采用双向玻璃体内注射氟尿嘧啶脂质体,可提高眼内药物水平,减慢周围组织的清除作用,注射48 h后,氟尿嘧啶眼内浓度为580 mg/L,而对照组氟尿嘧啶生理盐水溶液为1 mg/L。Assil等[13]比较了阿糖胞苷盐酸盐脂质体与其生理盐水溶液结膜下注射的眼内动力学,脂质体的组织半衰期为52.5 h,生理盐水溶液仅为0.2 h;脂质体组药物峰浓度为0.4 mg/L,对照组为19 mg/L,但8 h后对照组约余不到1%的药物,而脂质体72 h后,结膜及巩膜表浅组织中仍有30%的药物。Assil等[14]于兔玻璃体内注射脂质体,其半衰期为非脂质体的5倍。剂量为0.1 mg的脂质体对实验性PVR致牵拉性视网膜脱落发生率可以降低92%。

  3 角膜的靶向定位及基因经眼递送

  为提高靶向性和疗效可设计特异性脂质体。Norley等[15]制备的连结有抗细胞表面病毒糖蛋白抗体免疫脂质体,可以靶位于眼部疱疹病毒膜炎的病变部位,体外实验表明阿昔洛韦免疫脂质体,病毒感染后5 h给药,能特异性地与被感染细胞结合并抑制病毒生长,但游离药物及未免疫标记的含药脂质体无任何效果。:leyer[16]将D4+单克隆抗体(mAb)包封于脂质体中滴眼,观察对角膜移植排斥反应的作用,实验表明该脂质体与对照组比较能有效地减小排斥率,并延长有排斥反应移植角膜的存活时间。

  通常眼内给入基因药物需手术,Matsuo等[17]将β-半乳糖苷酸基因的传媒表达物包载于以TMAG/DLPC/DOPE(2∶1∶4),DDAB/DOFE(1∶12.5),DC-胆固醇/DOPE(1∶2)为载体材料的脂质体中,滴眼即可将该基因输送到眼后部视网膜神经细胞部位。Masuda等[18]研究了包载同样基因的脂质体不同给药途径下该基因的递送情况,结果表明局部滴用可将基因输送到视网膜神经细胞;前房内注射可输送到角膜上皮、睫状上皮、睫状体和虹膜间质、视网膜神经细胞、视网膜视上皮细胞。该基因递送研究为某些基因缺乏疾病如先天性视网膜发育不良的基因治疗开辟了一条新路。

  除上述给药系统外,还有静脉注射热敏脂质体,于眼的外部激光或微波加热,使脂质体于眼的特定部位释药的靶向制剂[19]。但由于该方法重现性较差,尚需理论上的探讨。

  4 脂质体眼部给药系统存在问题及发展方向

  目前,对脂质体在眼内各组织的行为有了基本的认识,对指导进一步的研究和阐明脂质体眼部给药的机理有很大帮助,但其可行性尚待考察。值得注意的问题有:(1)人眼内的效果未知,目前的结果均是在大鼠、兔眼内获得的;(2)体内实验所用脂质体标准不一,亟待制订较为统一的脂质体质量标准,使进行体内实验的脂质体质量合格,尽量减少实验偏差。(3)提高跨膜转运率仍存在困难,可设法提高与角膜表面的粘着力,或促进脂质体与角膜细胞的融合作用;(4)具有可识别病变部位,起主动靶向作用的免疫脂质体,因其特异结合性能,且不象静注全身给药那样易受各种不定因素的影响;结膜下或玻璃体内注射的脂质体,由于没有角膜的障碍,直接进入眼内起作用,可能是较有前途的给药途径。


第六课、脂质体在生物学中的应用新进展

陈吉祥,李广林,薛飞群,赵青云

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,兰州 730050)

  脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊,目前脂质体已应用于研究蛋白质与生物膜的相互作用、生物膜中离子的转运、药物与膜受体作用、酶催化活性模拟、包载药物、基因转移等方面。

  1脂质体的结构组成

  脂质体实际上是一个描述由化学和物理性质变化范围很宽的一些化合物的不同排列术语。它与胶束、微乳液、液晶、单分子膜、多分子膜、主――客体系等统称为"分子有序组合体",脂质体形状为球形,直径大小约为几十纳米到几十微米。根据脂质体形态结构不同,一般可将其分为三类:小单室双层脂质体、大单室双层脂质体及大多室脂质体。个别多室脂质体结构不一,有时出现大小不同的球形、洋葱式、椭球形或管状结构。

  2脂质体作为药物载体

  2.1脂质体作为药物载体的特点

  脂质体对机体毒副作用小,其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相溶性,易于被组织吸收。脂质体包裹药物为物理过程,不改变药物分子结构,当药物被包裹后可降低药物毒性,减小药物使用量,具有缓释和控释作用。各种分子大小的药物都可被包裹。可制备特殊性能的脂质体,如免疫脂质体、各种条件敏感性脂质体进行靶向给药,提高药物效果。

  2.2 抗癌药物脂质体

  细胞毒性药物对机体正常组织和病理部位无选择性,在使用中具有一定困难,最好的方法是使药物直接达到病理部位。Eric等研究表明,脂质体包裹的阿霉素比游离药物的毒性要降低50%一70%,在抑癌活性上脂质体剂型比游离药物高许多,用阿霉素脂质体多次治疗可增加荷瘤动物的存活时间,而使用游离药物时动物存活时间并不延长。许多药物如放线菌素D、丝裂霉素、氨甲喋呤、博来霉素、顺铂等都已用脂质体包裹,美国FDA已批准了阿霉素脂质体TLCD99、两性霉素B、柔红霉素脂质体进入临床试验。

  2.3抗寄生虫和真菌药物脂质体

  脂质体静脉注射后,可迅速被网状内皮系统所摄取,有些寄生虫病如利什曼原虫和疟原虫进入人体后是寄生于网状内皮系统。因此可用脂质体包裹药物,如用五价锑治疗时,药物毒性很大,其治疗剂量与毒性剂量相等,当用脂质体包裹后,治疗实验性利什曼原虫安全而有效,其治疗剂量大大减少。Das利用巨噬细胞表面存在的岩藻糖――果糖受体的特点,合成了含岩藻糖的脂质体并包裹锑的化合物,治疗感染了30d利什曼原虫的仓鼠;结果表明脂质体包裹的药物作用得到了加强(抑制率55%),含岩藻糖脂质体的作用更明显(抑制率72%),而不用脂质体的药物作用抑制率仅为26%。

  2.4多肽及酶类药物脂质体

  多肽、酶类药物都是生物大分子,其共同特点是在生物体内不稳定,易于被蛋白水解酶降解,因而在生物体内的半衰期较短,而且绝大部分不利于口服给药。超氧化物歧化酶(SOD)能清除体内过量的超氧阴离子自由基损伤,Amderson体内易于被蛋白酶水解破坏,当用脂质体包裹后,在生物体内的半衰期明显提高,而且脂质体能增加细胞对SOD的摄取能力,从而能更好地保护细胞免受自由基损伤。Amderson等研究表明皮下注射游离IL-2的半衰期仅为6min,而脂质体包裹的IL-2为68min,且脂质体包裹的IL-2体内分布和药物代谢动力学发生很大改变。胰岛素口服后由于胃酶和酸的破坏作用,生物利用度低,而用脂质体包裹后,可克服这些缺点,口服后动物血糖下降明显。

  3脂质体作为疫苗载体

  1974年Allison等首次报道用脂质体的免疫佐剂效应,Iinuna(1995)用MDP脂质体包裹流感病毒H3N2,冲免疫小鼠后,小鼠脾细胞可明显降低,转移致小鼠肺中的病毒滴度,表明MDP脂质体疫苗可通过增强细胞免疫来保护小鼠抵抗流感病毒攻击。Childers等将变异链球菌中的葡萄糖基转移酶(GTF)脂质体制成肠溶型胶囊,给7名健康成人口服每人每天500ug,连用3d,28d后再加强1次,结果5人的腮腺分泌物中抗GTF的IgA1和IgA2水平增加,第35天时达高峰,表明脂质体疫苗经口服后可诱导机体产生分泌型姑IgA抗体。脂质体作为疫苗佐剂可同时增强机体的体液免疫和细胞免疫。

  4脂质体用于免疫诊断

  具有荧光性的物质(如羧基荧光素)或酶活性物质(如碱性磷酸酶)包裹于脂质体中,再在脂质体上连接特异抗体,当脂质体上抗体与特异性抗原结合后,脂质体破裂,释放出荧光素,测其荧光强度,即可求出抗原含量。碱性磷酸酶(AP)包入免疫脂质体,而酶底物在脂质体外,当免疫脂质体与抗原结合后,脂质体膜通透性改变释放出AP,AP与底物反应而显色,该法可用于定性或定量分析,操作快速而简便,已用该方法进行了红斑狼疮、梅毒、乙型肝炎、单核白细胞增多症等的诊断及C一反应蛋白、免疫球蛋白、激素等药物检测。

  5脂质体用作基因治疗和核酸免疫中的DNA载体

  脂质体作为一种可供选择的基因载体具有无毒、无免疫原性、可生物降解的特点,可保护质粒DNA被核酸酶降解,能将目的基因DNA特异传递到靶细胞中。Nabel将HLAB7基因与DC-chol/DOPE阳离子脂质体复合物用于5例缺少HLAB7基因的黑色素瘤病人的治疗,注射3次不同剂量的DNA一脂质体复合物,用免疫化学方法在5例病人瘤组织中均检测到HLAB7蛋白的表达,其中1例病人间隔治疗两次后发现,注射结节及远处结节均见消退。Yoshihisa将?一半乳糖苷酶阳离子脂质体注射到荷ASPC一1肿瘤的裸鼠体内,于第三天测定转染活性,发现?一半乳糖苷酶在肿瘤组织中的表达高于正常组织。目前在美国实施的基因治疗方案中阳离子脂质体介导的基因传递系统占12项。

  1993年Robinson等将表达禽流感病毒(AIV)保护性抗原血凝素(HA)基因的质粒DNA注射小鼠和鸡,可对致死性的AIV攻击产生有效的免疫保护反应。Klavinskis将荧光素酶基因与阳离子脂质体(DMRIE/DOPE)复合物鼻粘膜单剂量接种,4周后可在血清中检测到IgA和IgG,而接种裸DNA后仅有微量的抗体存在,其荧光素酶活性增加了近30倍,荧光素酶基因DNA脂质体复合物能引起特异性CTL反应。Norman等将13OugCAT报告基因DNA与阳离子脂质体GAP一DLRIE结合,质粒DNA脂质体复合物与裸DNA鼻粘膜接种BALB/c小鼠,结果裸DNA接种2d后CAT蛋白表达量是0.02ng/mg,而脂质体DNA的蛋白表达量是0.02ng/mg,这表明脂质体DNA比裸DNA的表达量增加了45倍。

第七课、脂质体在药剂学中的应用

董秀兰  张宇星  张佐

哈尔滨医科大学第一临床医学院 黑龙江省药品检验所 黑龙江省药学会

  脂质体(Liposomes)是由磷脂胆固醇等为膜材包合而成。磷脂分散在水中时能形成多层微囊,且每层均为脂质双分子层,各层之间被水相隔开,这种微囊就是脂质体。脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体,含有表面活性剂的脂质体。按性能脂质体可分为一般质体(包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等)特殊性能脂质体、热敏脂质体、PH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按电荷性,脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。

  脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力。为克服脂质体作为载体的靶向分布不理想、稳定性较差的缺点,近年来开发了一些新型脂质体,如温度敏感型、PL敏感型、免疫、聚合膜脂质体。前体脂质体概念的提出和研究,提供了克服脂质体不稳定的较好思路。

  脂质体作为目前最先进的,被喻为"生物导弹"的第四代给药系统成为靶向给药系统的新剂型。

 
 1 脂质体的制备和质量研究

  1.1 制法 目前较为成熟的脂质体制备技术主要有以下两种:

  1.1.1 冻干法 该法采用低温干燥技术,通过反复包封、反复冻干来实现较高的包封率和稳定性。其主要缺点是制备工艺复杂、成本高,且脂质体的稳定性是在体外固态条件下实现的,还原为液态进入人体后,需采用特殊技术来控制脂质体的体内行为。

  1.1.2 组N型脂质体 该技术采用一组特殊的稳定剂来稳定脂质体的内相和外相。其特点是对水溶性物质一次包封便可实现70%以上的包封率、无需采用特殊方法便可实现极高的物理稳定性和化学稳定性,制备工艺简单,便于工业生产。尤其是用该技术制备的脂质体的体外形态与体内形态相一致,均为液态,从而大大提高了脂质体体内行为的可控性。

  1.2 脂质体的质量研究

  粒径及粒度分布:

  1.2.1 脂质体的粒径一般为nm级,用光学显微镜和电子显微镜粗略测量其粒径和粒径分布。

  1.2.2 测定包封率的关键是把未包封的游离药物从脂质体上分离出来,常用的分离方法有柱层析法、透析法、超速离心法、超滤膜过滤法等。

  1.2.3 渗漏率 渗漏率即为脂质体贮存期间包封率的变化情况,也就是贮存期间包封量的减少与刚制备脂质体的包封量之比。

  1.2.4 体外释放 脂质体中药物的释放速率与脂质体的通道性有关,体外释药速率的测定可初步了解其通透性的大小。

  1.2.5 体内实验 脂质体的高效低毒作用是通过体内实验得以验证的。采用药代动力学/药效动力学(PK/PD)模型系统,在这个系统中,PK参数用动力学实验数据分析法描述包封于脂质体的药物及未包封的药物在治疗部位的积蓄;而PD参数通过动物实验用来描述成活率及致死率,这个模型能够比较确切的预测和循环药物的体内释放率。

  脂质体区别于其它普通制剂的一个重要特点是其具有靶向性。脂质体的靶向性分为被动靶向性和主动靶向性,被动靶向性是脂质体进入人体后的自然分布,即静注体内的脂质体主要定位于肝、脾、骨髓、血液中的巨噬细胞等;而主动靶向性是改变脂质体被动靶向性的特点,使其定位于特定的细胞、组织、器官,这受到了脂质体粒子大小及毛细血管种类的限制。脂质体的靶向性可以通过放射性元素标记或高效液相色谱分析法检验得以验证。

  
2 脂质体的靶向性

  通过改变脂质体的给药方式、给药部位和粒径来调整其靶向,另外,还可在脂质体上连接某种识别分子,通过其与靶细胞的特异性结合来实现专一靶向性。

  靶向性是脂质体作为药物载体最突出的优点,脂质体进入体内后,主要被网状内皮系统吞噬,从而使所携带的药物,在肝、脾、肺和骨髓等富含吞噬细胞的组织器官内蓄积。

  2.1 天然靶向性 是脂质体静脉给药时的基本特征,这是由于脂质体进入体内即被巨噬细胞作为外界异物吞噬的天然倾向产生的。脂质体不仅是肿瘤化疗药物的理想载体,也是免疫激活剂的理想载体。

  2.2 隔室靶向性 是指脂质体通过不同的给药方式进入体内后,可以对不同部位具有靶向性,可以通过各种给药方式进入体内不同的隔室位置产生靶向性。在组织间或腹膜内给予脂质体时,由于隔室的特点,可增加对淋巴结的靶向性。

  2.3 物理靶向性 这种靶向性是在脂质体的设计中,应用某种物理因素的改变,例如用药局部的pH、病变部位的温度等的改变而明显改变脂质体膜的通透性,引起脂质体选择性地在该部位释放药物。弱离子性药物的脂质体,在进入体内后,可以选择性地在肿瘤的低pH局部释放药物。这种受pH影响释放药物的脂质体称为pH敏感脂质体。

  2.4 配体专一靶向性 这种靶向性是在脂质体上连接某种识别分子,即所谓的配体,通过配体分子的特异性专一地与靶细胞表现的互补分子相互作用,而使脂质体在靶区释放药物。

  
3 脂质体的分类

  3.1 阳性脂质体

  阳性脂质体(cationic liposome)又称阳离子脂质体,正电荷脂质体(Positiveiy charged liposome)是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。

  3.1.1 阳性脂质体的组成 大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成。

  中性磷脂成分:阳性脂质体中使用的中性磷脂成分上与常规脂质体相似,如胆固醇(cho1)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酚乙醇胺(PE)等。

  阳性成分:多为合成的双链季铵盐型表面活性剂,具有体外稳定性好,体内可被生物降解的优点,但均具有一定的细胞毒性。

  3.1.2 阳性脂质体介导的基因转染作用机制 介导转染过程中,阳性脂质体的主要作用在于DNA形成复合物,介导与细胞的作用,并将DNA释放到细胞中,实现基因转染。

  3.1.3 阳性脂质体在基因治疗中的应用 阳性脂质体作为一种可供选择的基因传递载体具有下列优点:

  (1)可防止核酸被体内物质降解,可将其特异性传递到靶细胞中;

  (2)无毒、无免疫性,具有生物惰性,可生物降解;

  (3)易于制备,使用方便,可将大的DAN片断转运到细胞中;

  (4)基因转染率高,100%离体细胞可以瞬间表达外源基因。

  阳离子脂质体的另一组分为不带电荷的中型脂质分子,叫辅助脂(helper lipid)DOPE是一种重要的辅助脂。

  3.2 隐性脂质体(长循环脂质体)

  隐形脂质体或长循环脂质体的组成中含有亲水性聚合物一聚乙二醇(PEG)的二硬脂酸磷酯酰胺(DSPE)的衍生物(PEG-DSPE)。

  3.3 免疫脂质体

  3.3.1 第一代免疫脂质体(IML) 是指连有单克隆抗体的脂质体。通过单克隆抗体与靶细胞的特异结合,将脂质体包载的药物导向靶组织,赋予脂质体主动靶向性。

  3.3.2 第二代免疫脂质体 此技术包括PEG含有的长循环脂质体,使抗体或配体结合到脂质体表面。

  3.3.3 第三代免疫脂质体 为了增加长效脂质体的靶向性,将抗体或其它配体连接于长效脂质体表面上的聚合物(如PEG)链的末端上,从而避免了PEG链对靶位识别的干扰,得到一种新型脂质体。

  3.4 柔性脂质体

  在脂质体组分中加入少量适宜的表面活性剂,可以形成柔性脂质体。柔性脂质体对水溶性大分子药物经皮渗透具有促进作用。

  普通脂质体粒径小于柔性脂质体,但由于无胆酸钠的存在,使刚性较大,难以促进药物的经皮转运。

  脂质体是将载药颗粒微细化的一种重要技术方法,虽然它本身并不是固体粉末,但是通过制剂的手段,可以将其制成各种固体粉末剂型。

  
4 脂质体的应用

  脂质体作为新型药物载体,当药物被包封后,可降低药物毒性,减少药物用量,进行靶向给药,提高药物疗效。

  为了提高药物的治疗指数,降低或减少药物的不良反应,用卵磷脂和胆固醇作为脂质体的载体材料。

  若将水不溶性的口服药物制成静脉注射液,就须将药物的粒径降低到亚微米或纳米状态(1μm以下)。在制剂中常用的微粒制备方法有薄膜蒸发-冷冻干燥法、乳化热固化法、溶煤蒸发法等。

  4.1 抗肿瘤药物的载体

  脂质体作为抗癌药物载体,具有能增加与癌细胞的亲和力、克服耐药性、增加癌细胞对药物的摄取量、减少用药剂量、提高疗效、减少毒副作用的特点。

  4.2 激素类药物的载体

  抗炎甾醇类激素包入脂质体后具有很大的优越性,浓集于炎症部位便于被吞噬细胞吞噬,避免游离药物与血浆蛋白作用,一旦到达炎症部位就可以内吞、融合后释药,在较低剂量下便能发挥疗效,从而减少甾醇类激素因剂量过高引起的并发症和副作用。

  将胰岛素以脂质体为载体,以求提高生物利用度和病人的顺应性。但仍存在包封率低和药物在胃肠道失活问题。脂质体内包含有胰岛素,包裹率为20.3%。胰岛素脂质体可抵抗胰蛋白酶对胰岛素的降解。

  4.3 酶的载体

  脂质体的天然靶向性使包封酶的脂质体主要被肝摄取。脂质体是治疗酶原贮积病药物最好的载体,有人应用包封淀粉-葡萄糖酶的多室脂质体治疗II型糖原贮积。

  4.4 解毒剂的载体

  EDTA或EDPA可以溶解金属,治疗金属贮积病。但由于这些螯合物不能通过细胞膜而影响了它们的体内效果,如果将螯合物制成脂质体剂型,脂质体作为将整合物转运到贮积金属的细胞中的载体。

  4.5 抗寄生虫药物的载体

  脂质体作为网状内皮系统的药物载体是脂质体最成功的应用之一。利用脂质体的天然靶向性,可以用其治疗网状内皮系统疾病。

  4.6 抗菌药物的载体

  利用脂质体与生物细胞膜原剂量的1/10即可具有透过角膜作用。

  4.7 透皮给药的载体

  脂质体以其良好的生物相容性和促进药物透皮吸收特性作为经皮给药载体己成为一个研究热点。

  脂质体中脂质的组成对药物的渗透有一定的影响。由极性接近皮肤的神经酰胺、胆固醇、脂肪酸和胆固醇硫酸酯等组成的所谓角质脂质体,可使药物有较大的皮肤透过性和稳定性,这是由于与角质层有相同的脂质,易互相融合所致。脂质体脂质的流动性也影响药物透皮渗透性。固态脂质体与皮肤的结合少于液态脂质体,液态脂质体增加角质层脂质的流动性,而固态脂质体降低角质层脂质的流动性,液态脂质体促进透皮的效果优于固态脂质体。

  
5 前体脂质体(proliposome)

  又称重建脂质体系脂质体的前体形式,通常为具有良好流动性能的粉末,应用前与水水合即可分散或溶解成脂质体。它具有脂质体制剂的一系列作用特点,又可提高药物的疗效,减少药物的毒副作用,而且增加制剂的稳定性和高温灭菌等问题,为脂质体的工业化生产奠定了基础。

  5.1 前体脂质体的类型

  固体形式、液体形式,这两种形式的前体脂质体,均成功解决了脂质体以混悬液形式贮存的一系列稳定性问题,如药物渗漏、粒子聚集、磷脂氧化降解等,有利于脂质体制剂的工业化生产和商品化。

  5.2 前体脂质体的组成

  
在前体脂质体处方中加入不同的附加剂,可以显著影响所生成脂质体的性质和功能。

  5.3 包封的药物

  前体脂质体广泛用于包封各种脂溶性和水溶性药物。

  5.4 前体脂质体的制备

  前体脂质体多采用先制备脂质体,再进行特殊处理,目前较成熟的方法有冻融法、重建法、喷雾法、喷雾干燥法、旋转蒸发法,所制得均为干燥粉末。

  5.5 前体脂质体的体内性质的研究

  以各种方法制得的前体脂质体,要对其再分散性质进行深入研究。如粒径及粒度分布、包封率、考察不同制备方法中具体的影响因素,以期提高包封率,增强疗效。其它性质如体外释药、吸收分布、代谢、前体脂质体与脂质体类似。

  5.6 前体脂质体在药剂学中应用

  生物技术的不断发展和制备工艺逐步完善,加之前体脂质体具备脂质体的一系列特点,使前体脂质体包封药物越来越受到重视并得到广泛应用。

  5.6.1 抗肿瘤药物载体

  前体脂质体作为抗癌药物载体具有能增加与癌细胞的亲和力,克服耐药性,增加药物被癌细胞的摄取量,降低用药剂量,提高疗效,降低毒副作用的特点。携载化疗药物是目前前体脂质体的主要应用方式。

  5.6.2 抗网状内皮系统疾病药物载体

  由于脂质体的天然靶向性,使网状内皮系统的器官和细胞成为靶区,携载药物的前体脂质体进入体内后,可定向将治疗药物有效地运送到网状内皮系统患病细胞中,释放药物。

  5.6.3 抗菌、抗病毒药物载体

  利用脂质体与生物细胞膜亲和力强的特性,将抗生素包裹前体脂质体内可提高抗菌、抗病毒效果,同时能明显降低某些药物的毒性。

  5.6.4 其它

  前体脂质体还用于包封激素类、酶、解毒剂、免疫激活剂、抗结核药等,尤其还用于一些由于不稳定不能用脂质体包封的药物。

  前体脂质体可有效解决普通脂质体的聚集、沉降、融合渗漏和高温灭菌等问题,而且制成前体脂质体制剂,药物疗效增强,副作用降低,因此研究开发前体脂质体是使脂质体走向工业化和商品化的方向之一。


 

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