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整合酶抑制剂的发现和发展
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2014-4-10          ★★★【字体:

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整合酶抑制剂的发现和发展
Discovery and development of integrase inhibitors
译自Wikipedia百科全书
汤教授注:本文是作者配合2013年8月美国FDA批准 ViiV Healthcare公司新整合酶链转移抑制剂治疗HIV感染药的基础知识,也许有些帮助。
第一个人类免疫缺陷病毒(HIV)病例是在80年代报道。已发现许多药物治疗该病但病毒的突变和对药物的耐药使得发展很困难。整合酶[Integrase]是一种病毒酶整合逆转录DNA为宿主细胞的基因组。整合酶抑制剂是用来治疗HIV的一类新药。2007年批准了第一个整合酶抑制剂,拉替拉韦[raltegravir],而2011年其他药物在临床试验。
内容
1 历史
2  HIV-1整合酶
2.1 结构
2.2 功能
3 作用机制
3.1 整合酶链转移抑制剂 (INSTIs)
3.2 LEDGF/p75- 整合酶相互作用的抑制
3.3 整合酶结合抑制剂
4 药物设计
4.1 结合
4.2 结构活性相互关系(SAR)
4.3 药效团
4.4 耐药
5 当前状态
6 还见
7 参考资料
 
历史
在20世纪80年代,一种传染性疾病开始困扰着人类文明。病毒和人类的共存对于彼此都是为生存而斗争因为侵入者可杀死人但是也正在消灭它们自己的宿主。机体利用它的免疫系统保护自己免受细菌,病毒和其他引起疾病,而失败时发生免疫缺陷疾病。一种这类疾病被称为获得性免疫缺陷综合征爱滋病(AIDS)是被人类免疫缺陷病毒感染(HIV)最常见结果[1]。曾鉴定两种密切相关类型的HIV,HIV-1 和 HIV-2。而HIV-2在印度和西非播散,HIV-1更致命和世界上第一爱滋病的原因。虽然患者的有些有不同结果在大多数病例中HIV感染人们继续发展成爱滋病AIDS和最终死于 机遇性感染或癌症。整合作用对逆病毒基因组对基因表达和病毒复制是至关重要的。病毒基因组被病毒逆转录酶被逆向地转录至被感染细胞的DNA,然后借助于病毒整合酶DNA被整合至宿主细胞染色体。从被整合的病毒DNA生成RNA转录和用如mRNAs指导病毒蛋白的合成和后作为新病毒颗粒RNA基因组。从质膜通过芽生病毒颗粒从细胞逃逸,各封闭在包膜[membrane envelope]内[2] 。在这个过程中HIV-1整合酶是重要和因此对抗-AIDS药物设计非常有前途发靶点。选择性药物设计是作为HIV-1整合酶可能性无已知细胞等同物[3]。曾发现和设计许多整合酶抑制剂但只有少数分子被进一步开发和得到远至 II期或III期 of 临床试验。2007年10月FDA授予拉替拉韦(商品名Isentress®)加速批准和2007年12月从EMEA (现 EMA) [4][5]。它作为一个抗病毒药物 (ARV)对HIV-1公认的成年早已被暴露于最少三个抗病毒药类型和显示多药耐药上市。一般说来,有两种主要整合酶抑制剂组;整合酶链转移抑制剂(INSTI)和整合酶结合抑制剂(INBI)。INSTIs抑制预先整合复合物(pre-integration complex, PIC)和宿主DNA的结合和INBIs抑制整合酶和病毒DNA结合。拉替拉韦是一种INSTI整合酶抑制剂抑制HIV-1和HIV-2二者复制。它比其他既往已知整合酶抑制剂更强以及引起较轻副作用。拉替拉韦是当前正在被用于治疗 HIV感染唯一的HIV-1整合酶抑制剂 但其他药物是临床试验,如elvitegravir和S/GSK1349572[4][6][7][8]。
HIV-1整合酶
HIV-1整合酶(IN)是在逆转录病毒复制机制一个关键酶[9]。负责病毒编码DNA转移至宿主染色体 ,这是在逆转录病毒复制中必要事件[10]。因为在宿主细胞中无整合酶等同物,整合酶抑制剂有高 治疗指数因它们不干扰正常的细胞内过程[11] 。
结构
整合酶,机制上和结构上两方面属于polynucleotidyl转移酶10超大家族和由288个氨基酸形成32 kDa蛋白[9]。逆转录病毒编码其酶(蛋白酶, 逆转录酶和整合酶)与POL基因对整合酶有3´端编码组成[11] 。



图1:  HIV-1整合酶的结构结构区
整合酶由3个独立,功能性结构区组成(见图1):[9]
1.  N-端结构区(NTD)包括 氨基酸 1–50和含两个组氨酸残基(His12和His16)和两个半胱氨酸残基(Cys40和Cys43),所有都是绝对保守和形成一个HHCC锌-指结构域[9][12]。这些四个残基任何单突变减低整合酶酶活性[11]。HHCC锌-指结构域螯合一个锌原子每个整合酶单体。对NTD需要高级(order )多聚体形成似乎是它的主要作用[12][13]。多聚合化需要锌原子稳定折叠[12] 。
2. 催化核心结构区(CCD),包括氨基酸51- 212,含整合酶的活性位点但在缺乏NTD和CTD(C-端结构区)它不能催化整合[11]。CD含三个绝对保守的负性电荷的氨基酸;D64,D116和E152[9]。 这些氨基酸形成DDE结构域协调双价金属离子(Mg2+或Mn2+)。对整合的催化这些金属离子是重要的[12][13]。CCD有一个混合的β和α结构与5个 β-片和6个 α 螺旋通过灵活环连接[12]。灵活环允许病毒DNA和链转移(STF)反应的3´处理所需的构象变化,是整合作用反应的两个关键步骤[9] 。对这些步骤CCD是重要的和在DDE结构域中任何残基的取代急剧抑制的活性[12]。
3. C-端结构区(CTD),包括氨基酸213–288,非特异性地结合DNA和对整合酶3´-处理和链转移活性CTD需要与NTD和CCD相互作用[11][12]。CTD是三个结构区保守最小的结构区[12]。整合酶作用如同一个多聚体和为3´-处理步骤二聚化所需,与四聚化整合酶 IN催化链转移反应。
功能
通过一个多步骤过程发生HIV-1整合作用其中包括两个催化反应: 前病毒的DNA端的3´内切核苷酸的处理(被称为3´处理)和3´-处理病毒DNA至细胞DNA的整合作用(被称为链转移)[6]。在3´处理整合酶结合至位于病毒DNA的长末端重复序列[long terminal repeat ](LTR)的任一端一个短序列和催化核苷酸内切裂解[endonucleotide cleavage]。结果从LTR的3´端的各消除一个双核苷酸[dinucleotide]。然后裂解DNA被用作为整合作用或链转移的底物[9]。链转移是一个酯基转移反应[trans-esterification reaction]涉及宿主目标DNA的磷酸二酯骨架上新近被处理的两个病毒3´-DNA端的一个直接亲核攻击[14]。这导致 病毒DNA共价插入至被感染细胞的基因组。链转移同时地发生在病毒DNA分子的两端,在插入两对侧点间精确地有5个碱基对的分支[9] 。通过从病毒DNA的5'-端去除未配对的双核苷酸完成整合作用反应,病毒和目标DNA分子和宿主DNA的3'-端至5'-端的结扎[ligation]间创建单链缺口的修复[repair of the single-stranded gaps created] [9][14]。对3'-处理和链转移步骤以及为整合酶的组装至特异性病毒供体DNA形成复合物需要双价金属,Mg2+或Mn2+主观进行任一功能。因为在细胞内Mg2+比Mn 2+丰富度超过1,000,000-倍它是整合作用更好的辅助因子[6]。
作用机制

图2:病毒RNA至宿主细胞DNA的整合作用
有几种途径目标整合酶但链转移抑制是最常用的一个。其他目标包括,例如,超出整合酶的活性位点蛋白结构区。结构区与病毒或宿主DNA相互作用和对与酶结合是重要的。通过破坏或去除这些结合可能阻碍酶功能。预先整合复合物(pre-integration complex, PIC)是在宿主细胞内一个多聚体蛋白结构,由病毒和宿主两者蛋白组成。整合酶是PIC的病毒一部分组分。PIC的病毒和宿主蛋白被认为调制酶的内在活性,PIC穿梭至至细胞核和病毒DNA直接整合转录至宿主基因组活性区。如过有可能从PIC排除某些蛋白将会阻断病毒整合至宿主基因组的能力。图2中显示逆病毒 RNA被转录至DNA和然后整合至 宿主细胞的基因组的过程[8]。
整合酶链转移抑制剂(INSTIs)
Mg2+和Mn2+是在整合酶相中关键性辅助因子和如果它们被螯合可能引起整合酶的功能性损伤。这给予设计和开发高效整合酶抑制剂(INIs)的机会。事实上,现在研究的所有小分子HIV-1 INIs 含一个结构结构域协调酶的活性位点中两个双价镁离子[6]。
拉替拉韦和elvitegravir共享对整合酶相同作用机制是与Mg2+离子的活性位点结合[8] 。抑制剂与病毒DNA对结合至整合酶为了抑制3‘-端处理直接地竞争[15]。 为此抑制剂完全阻断来自结合至目标 DNA活性位点。这个抑制作用的途径被称为链转移抑制[8]。
LEDGF/p75-整合酶相互作用的抑制
晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF/p75)是一个结合至整合酶的宿主蛋白和对病毒复制至关重要。作用机制没有精细地已知但证据提示LEDGF/p75指导整合酶插入病毒DNA转录地至宿主基因组活性位点。这个蛋白的抑制剂早已被开发和专利化。它们很可能高度靶向特异性和不太容易发生耐药[8]。
整合酶结合抑制剂
INIs的另外类别可能是整合酶结合抑制剂(INBIs)例如V-165。V-165是一个化合物显示抑制整合作用但对病毒DNA合成没有明显效应。当研究作用机制显示V-165干扰病毒DNA-整合酶复合物形成。由于其干扰作用它被分类为整合酶结合抑制剂。其他化合物,例如styrylquinolines共享通过与LTR底物竞争对整合酶结合相同机制[16]。
药物设计
结合
INSTIs紧密和特异性地结合至关联DNA的端整合酶通过螯合双价金属离子(Mg2+)协调催化三合[triad]即DDE[催化核心结构区的氨基酸D64 D116 E152,其中D为天冬氨酸,E为谷氨酸]结构域[9]。 DDE结构域位于整合酶的催化核心结构区[CCD]内和是酶的活性位点和因此INSTIs也被称为活性位点抑制剂。INSTIs结合至接近整合酶DDE结构域特异性位点,一个位点只在3´病毒DNA端的处理后构象中存在。病毒DNA可能很好形成抑制剂结合位点的一部分。结合是变构抑制的形式 因它意味着一种特异性整合酶-病毒DNA复合物的阻断[12]。这导致链转移反应的选择性抑制,与对3´-处理反应无显著影响[9] 。因此INSTIs 可能是更特异性和选择性地结合至靶点DNA结合位点和因此比双功能性抑制剂可结合至供体和靶点结合位点[12]毒性更低。
INBIs 还结合至整合酶但作用机制不知道所以不能详细说明结合[16]。
结构活性相互关系(SAR)



 

图3: Elvitegravir和拉替拉韦的结构活性相互关系。在一个疏水性囊中一个苄基和两个Mg2+离子三合[triad]螯合.
对整合酶结合需要两个结构组分:一个疏水性苄基 部分埋藏至接近活性位点高度疏水性囊;和螯合三合在一个相当亲水性区与两个Mg2+离子结合,对接抑制剂至蛋白表面(见图3) [17]。 事实上,所有强整合酶抑制剂具有被取代的苄基组分对维持3'端连接效力至关重要。去除苄基阻止抑制功能[15]。所以亲脂性取代对链转移抑制有益,尤其是噻吩,呋喃和(噻吩-2-基)苯基取代。杂环胺和酰胺也引起3‘-处理抑制作用增加[6]。

图4: 整合酶抑制剂的实例.

当研究整合酶的基于邻苯二酚抑制剂观察到维持双羟基芳环平面相互关系增加效力。通过包括一个间氯取代基进一步优化抑制活性,增强苄基与邻近疏水性囊的相互作用(见图4: A-G结构) [8]。
一个羟基取代的苄基(图4 H)改进金属-螯合能力(与图4中结构J比较)而一个甲氧基(I)效力低得多由于通过加入甲基与催化金属立体冲突[15]。
当研究二酮衍生物,图4中结构K的中央吡咯环被一系列有不太取代模式的芳香系统取代。提供苄基和二酮酸(DKA)位点链相对方向最优化。图4中结构L导致效力增加100倍[18]。
Benard等(2004)有喹啉亚单位的合成整合酶抑制剂[INIs]和一个附属连接功能化间隔的芳香环例如酰胺, 肼,尿素和羟基丙-1-烯-3-酮部分。他们发现含酰胺基衍生物是最有前途的[18][19] 。通过合成系列styrylquinones研究者发现对抑制作用需要在喹啉亚单位和一个附属苯环C-7位一个羧基,C-8上一个羟基(图4: 结构M),虽然改变环被耐受。附属苯环上两个羟基也是抑制效力所需要的[18]。
药效团



图5:二酮酸(DKA)的结合与整合酶的DDE氨基酸残基 
因为对HIV整合酶催化关键性结构资料稀缺,很难发现对其抑制的确切药效团。Wang等(2010) hoped that通过研究构效相关[SAR]和双重抑制剂骨架的药效团,重点是整合酶和逆转录酶(RT)有可能观察抗整合酶活性。通过研究HIV整合酶抑制剂的构效关系可能发现对优化整合酶抑制作用药效团 要求一个区域特异性(N-1)二酮酸DKA的特异性长度。一个二酮酸功能性或其杂环生物电子等排体[heterocyclic bioisostere]似乎存在于整合酶抑制剂的所有主要化学类型中似乎存在选择性抑制链转移[17]。如前SAR讨论所述整合酶抑制剂INI两个必要的结构组分是苄基疏水性部分和一个螯合三合[triad]结合Mg2+离子。对三合结合Mg2+离子必须被电离(见图5)和因此药效团生物电子等排也必须被电离和苄基药效团生物电子等排必须非常疏水性[11][17]。
但是,尽管在临床开发中既往成功(拉替拉韦),缺乏详细结合模型因此已被证明难以基于结构设计整合酶抑制剂。当现水杨酸和邻苯二酚效团,创建新化学骨架。在水杨酸上邻近羟基和羧基可能与金属离子结合和用作其药效团。多羟基芳香抑制剂是大多数对链转移反应和3‘-处理活性提示靶向两个步骤的一种机制。这是化合物的非常重要部分因它可被用于结合在整合酶上的双价金属活性位点和因此对链转移特异性抑制剂耐药病毒株有效[ 6][17]。
耐药
已被发现INSTI突变引起 体内和体外耐药的超过60个变异。由于这些突变和耐药的发生抑制剂是对病毒有效较低[9] 。INI的耐药相当于其他抗病毒ARV药物。首先整合酶耐药通过主要突变减低INI敏感性与次要突变进一步减低病毒敏感性和/或减低病毒适当性修复的结合引起的。第二对INI耐药有遗传屏障,被定义为对丧失临床 INI活性需要的突变数。第三有广泛但INIs之中不完全交叉-耐药[13]。一个环含氨基酸140–149残基位于催化核心结构区和如上所述对整合酶功能是重要的。这个环是灵活的和甚至虽然其作用不十分知道它被认为是重要的和其功能对DNA结合至关重要。耐药性似乎在这个整合酶-编码区内突变[9]。对拉替拉韦和elvitegravir的耐药主要是由于相同的两条突变途径但对药物的每一个也涉及其他主要突变[10]。有些突变对药物增加耐药比对其他程度大。例如增加耐药对拉替拉韦最常见突变途径比第二常见突变高100倍以上[9] 。耐药对整合酶抑制剂 S/GSK1349572仍正在开发和尚未完全知道耐药特征。当它与拉替拉韦和elvitegravir的主要突变并排评估它不显示交叉-耐药这意味着对耐药病毒有用[7]。 拉替拉韦曾限于小肠吸收和因此耐药不能被处方更高剂量克服。较新药物必须克服这个药理学缺点和得到足够目标拉替拉韦-耐药病毒血浆浓度[7]。
当前状态

 
图6: MK-2048的结构与突出重要的药效团
寻找被HIV感染患者治疗的改进的新方法是恒定的。考虑从20世纪80年代 ARV药物开发集合的经验INSTIs作为新强ARV类型的到来信号HIV治疗的一个新时代。当拉替拉韦被Merck Sharp & Dohme Limited发现完成了INSTI治疗的成功开发[12]。2007年12月被欧洲委员会授权有条件许可上市在遍及全欧盟有效[20]。 In 2009年这个授权被转换为完全上市和在同一年FDA改变批准从加速至传统批准和将本药列作为一线ARV治疗药[12][21]。日本Tobacco鉴定第二个整合酶链转移抑制剂INSTI药物,elvitegravir,和2005年年开始临床试验。在2011年药物仍在3期临床试验,其中正在与拉替拉韦比较,治疗经历的受试者和还在两个未治疗过受试者作为多药处理的一个部分[12]。S/GSK1349572是一个整合酶抑制剂被ViiV/Shinongi发现进入3期。在2011年进入3期临床试验。这个新药是有前途和似乎被很好耐受和迄今显示比拉替拉韦和elvitegravir 两者更好结果[22]。
自从对拉替拉韦和elvitegravir有耐药问题,科学家们已开始对新第二代整合酶抑制剂,例如2009年Merck开发MK-2048。它是第二代INSTI样板对含对拉替拉韦和elvitegravir突变的病毒维持效力。MK-2048的作用机制和SAR与其他INSTIs相同,图6中显示MK-2048的结构与突出重要的药效团[23][24]。尽管上面所讨论药物有前途开发还有长路程走而关于这些药物的疗效,安全性和作用机制仍有许多事情不知道[7]。
还见
拉替拉韦
Elvitegravir
整合酶
整合酶抑制剂
HIV
逆转录酶
MK-2048
Dolutegravir[汤教授注:2013年8月 12日美国FDA批准]
参考资料
1.Johnson, Dee Unglaub Silverthorn ; with William C. Ober, illustration coordinator ; Claire W. Garrison, illustrator ; Andrew C. Silverthorn, clinical consultant ; with contributions by Bruce R. (2007). Human physiology : an integrated approach (4th ed.). San Francisco: Pearson/Benjamin Cummings. ISBN 0-8053-6849-3.
2.Janeway's immuno biology. (7th ed.). New York: Garland Science. 2008. ISBN 978-0-8153-4123-9.
3.Pommier, Y; Marchand, C, Neamati, N (2000 Sep). "Retroviral integrase inhibitors year 2000: update and perspectives". Antiviral Research 47 (3): 139–48. . 
4.Dąbrowska, Magdalena Monika; Wiercińska-Drapało, Alicja (1 Jan. 2007). "Integrase inhibitors as a new class of ARV treatment". HIV & AIDS Review 6 (4): 10–14. .
5."FDA approval of Isentress (raltegravir)". U.S. Food and Drug Administration (FDA). Retrieved 25 Sep. 2011.

 

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