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为探测蛋白治疗药更高级结构的氢/氘交换质谱:方法学和应用
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2014-4-10          ★★★【字体:

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  •  为探测蛋白治疗药更高级结构的氢/氘交换质谱:方法学和应用 

Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeuticsmethodology and applications 

Hui Wei1Jingjie Mo1Li Tao2Reb J. Russell3Adrienne A. Tymiak1Guodong Chen1Roxana E. Iacob4John R. Engen4 1 BioanalyticalDiscovery Analytical SciencesResearchDevelopmentBristol-Myers SquibbPrincetonNJUSA 2 Biologics ManufacturingProcess DevelopmentGlobal ManufacturingSupplyBristol-Myers SquibbHopewellNJUSA 3 Biologics ManufacturingProcess DevelopmentGlobal ManufacturingSupplyBristol-Myers SquibbBloomsburyNJUSA 4 Department of Chemistry & Chemical BiologyNortheastern UniversityBostonMAUSA 

教授注:氢/氘交换质谱(HDX-MS)是最近发作的质谱新技术对蛋白药物相互作用和生物药物可比性研究特别有用。这篇文章值得关心质谱技术和工作涉及这方面技术的人员(请别人做)都值得阅读。

 

用氢/氘交换质谱(HDX-MS)可了解蛋白治疗药更高级结构。现在HDX-MS是蛋白治疗药的结构特征有用工具。在本综述中,展示对蛋白治疗药发现和发展过程中基于HDX-MS工作流程设计,集中对蛋白/药物相互作用和生物药物可比性研究抗原表位作图的特异性应用。还描述蛋白治疗药特征中HDX-MS的未来趋势。

 

引言

从上世纪80年代初引入第一个种族蛋白治疗药 – 人类胰岛素[1] ,蛋白治疗药已作为重要治疗药出现。蛋白治疗药现在是疫苗后第二大生物药学产品类别。在其中,基于抗体药物是蛋白治疗药中最大和最快-增长类别有多于40个抗体和抗体衍生物被批准使用,和350 更多在整个临床管道包括28个正在临床试验后期研究[24]。与小分子药物比较,蛋白治疗药有独特特点和功能不能用合成的小分子模拟。在溶液中,在生理学条件下,蛋白质折叠成独特的3D结构使其生化功能和与靶点相互作用。就是这些3D结构,因此,随后负责药物疗效。所以,在生物制药行业分析工具提供有关关键性重要的蛋白较高级结构信息[58]

/氘交换(HDX)代表一种被广泛使用的技术为探索蛋白质溶液构象[9,10]。这个方法依赖于蛋白质骨架酰胺氢与溶液中到的交换。涉及的骨架酰胺氢在弱氢键或位于蛋白质表面可迅速地交换,而那些埋藏在内部或涉及稳定氢键较慢交换。通过测量骨架酰胺氢HDX率可得到蛋白动力学和构象信息。HvidtLinderstrom-Lang1950年代中期描述氢交换特征,首先用胰岛素,并显示较慢酰胺氢交换率反映氢键的存在[11,12]。可用几种分析技术检测氘交换至蛋白包括NMR光谱[13]和傅里叶变换红外(FTIR)光谱[14]。通过交换质谱(MS)也容易测量氘质量大于氢。1991KattaChait进行了第一个偶联电喷雾电离质谱(ESI-MS)HDXMS探查蛋白构象变化[15]。然后这个方法与酶消化配对,根据RosaRichards早期工作[16],使对短胃酶解肽[peptic peptide]结构变化定位[17]。虽然多肽-水平HDX-MS可提供的空间分辨率与其他结构技术一样高例如NMRX-线晶体学,HDX-MS不手或蛋白大小或晶体性质限制,对NMRX-线技术这些可能是限制因素。 此外,HDX-MS实验用小量样品(皮摩尔量)可能提供有用信息,可以用于研究难以纯化或结晶的蛋白质,在宽广时间尺度揭示蛋白构象动力学和可倍用于研究复杂蛋白系统[18,19],在过去二十年,HDX-MS技术已涉及在HDX方法学和MS仪器的进展(硬件和软件),并已成为一个必不可少的工具为在溶液中蛋白治疗药较高级结构的研究[20,21]HDX-MS 在生物制药行业中应用范围从蛋白治疗药发现至发展,包括蛋白质构象的研究,修饰后构象动力学,折叠/重折叠,蛋白质-配体/蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白集聚[2227]。在本综述中,我们讨论一般HDX-MS实验方法和技术的当前应用:(i) 探查抗原-抗体结合界面(抗原表位作图)在药物发现和(ii) 在产品发展中抗体药物的可比性研究。

1 总体方案对氢/氘交换质谱(HDX-MS)实验. (a)连续标记和(b)脉冲标记,接着通过或全体-水平或多肽-水平分析。缩写:LC/MS,液相色谱/质谱。经允许,引自[28]

方法学

HDX实验中,当蛋白质中的不稳定氢原子与溶液中氘交换时发生蛋白质标记。通过HDX履行蛋白质标记有两种主要方法:连续标记和脉冲标记[28] (1)。在连续标记方法中,蛋白样品的几个等份在维持其天然构象条件下被暴露至氘缓冲液(pH 7和生理缓冲条件下)。 在氘缓冲中蛋白质样品的一份被培养某个时间和然后标记被淬灭,这个战略监测氘掺入至蛋白质机构的时间函数,提供某个蛋白质在平衡条件下构象动力学信息。在脉冲标记方法中,某种蛋白首先以某种方式被扰动,例如通过加入化学变性剂,形成复合物,改变pH或改变温度。然后蛋白暴露于氘缓冲液(典型地用较高pH,如pH 810)共非常短时间(典型地10 s或更短)[29,30]。用一个短脉冲时间,HDX将只发生在暴露于溶剂的位置和不涉及氢键。

任一种标记方法后,氘标记[deuterated]蛋白是位于低pH(pH 2.5)缓冲液在低温度减少交换率和淬灭随后分析步骤期间反应。在随后分析步骤中淬灭条件减小反向交换[17]MS被用于测量氘掺入至蛋白质。可在完整蛋白水平进行测量揭示总体氘掺入或在多肽水平揭示局部交换信息。重要的是注意到成功HDX-MS实验要求实验方案的仔细设计[21]和快速,但有效,色谱分离在低温度(0°C)控制氘反向交换[17,31]。对多肽-水平HDX-MS,被酶消化后淬灭 (用酸蛋白酶)和通过液相色谱(LC)快速分离。也进行非氘标记对照实验鉴定在酶消化期间产生的全部胃酶解肽。胃蛋白酶是在HDX中最广泛使用的蛋白酶因为它稳定和在酸性淬灭条件下高度活性;在相同消化条件下胃蛋白酶消化是可重现性[32]。胃蛋白酶消化通过重叠多肽产生丰富信息,在多肽-水平HDX有助于细化氘定位。

通过测量的质谱仪内来自氘标记胃酶解肽创建的重叠碎片离子的氘水平也可以得到空间分辨HDX-MS信息。HDX气相碎片的主要缺点之一是与氢加扰[hydrogen scrambling]有关,意味着可能发生多肽酰胺氢分子内迁移,特别是在传统的碰撞诱导解离[collision-induced dissociation, CID)碎片化[33]。非遍历碎片[Nonergodic fragmentation]技术用最小的振动激发例如电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)是在HDX-MS实验首选的激活方法因为它们最小氢加扰[34,35]。利用模型肽系统曾实现酶消化和气相碎片化结合碎片化,为氘掺入测量单-酰胺分辨[36]。这个复发曾被应用于淀粉样原蛋白β2-微球蛋白构象动力学特征化[37]和过氧化物酶体增殖物激活受体和配体间相互作用[38]。仍有待观察是否电子转移解离(ETD)将成为在HDX 中常规方法,因为几个因素 – 包括电子转移解离(ETD)效率,在超--效液相色谱LC (UHPLC)中狭窄的色谱峰和一般缺乏考虑电子转移解离(ETD)/HDX –软件仍阻碍广泛实施。

HDX-MS应用

抗原表位作图

非共价结合事件,例如蛋白–蛋白相互作用和蛋白–配体相互作用,是涉及许多药物作用机制[39]。了解抗原-抗体相互作用和鉴定抗原表位在药物发现中对有效蛋白治疗药的设计是至关重要的[4,18,40]。抗原表位区也需要专门作图确保可得到专利性和保护独特的知识产权。X-线晶体学为抗原表位特征提供最高点分辨率(原子分辨率)。但是,许多抗原-抗体结晶复合物是很难得到的。NMR光谱学往往限制于较小的蛋白质(<25 kDa)。合成肽阵列的扫描[对短噬菌体展示多肽的亲和力选择性与关注单抗(mAb)]使抗原表位鉴定;但是,由于抗原表面存在的氨基酸基序[motifs]mAb-结合区内实际存在的氨基酸基序相似预测可能发生错误[41]。通过合成肽阵列可能不能鉴定构象抗原表位。虽然用MS有限的蛋白水解可用于探查抗原表位通过媒消化固化的抗原-抗体复合物[42],由于要求抗体固化这个方法是很费力的,而不稳健因为不同实验室生成的实验结果变异性。空间分辨HDX-MS是为生理条件下用作分析抗原-抗体相互作用添加的一种工具。当一种蛋白复合物形成,结合伴侣[binding partners]间界面可能遮挡[occlude]溶剂,因此作为空间排阻溶剂的结果减低交换率。但是,几种其他因素使交换进入蛋白复合物的解释复杂化,如文献内[18]和下面所述。例如,通过结合相互作用可交换的酰胺氢稳定化也可能导致交换率的减低。

为探查结合位点,通常用游离抗原进行HDX实验和作为抗原–抗体复合物的参比实验。从这两个实验生成的数据和具有不同交换动力学蛋白中区域比较被突出作为潜在抗原表位(2)


2通过氢/氘交换质谱(HDX-MS)对抗原表位作图方案。缩写:LC/MS,液相色谱/质谱;mAb,单克隆抗体。

每年发表越来越多用不同标记方法的HDX-MS抗原表位作图研究[23,25,4345]。为了说明对抗原表位作图HDX-MS方法,下面简要描述自连续标记方法一个例子规定保护性抗原表位对因子H 结合蛋白(fHbp) [44]

fHbp是一个表面-暴露脂蛋白和两种当前临床开发中的脑膜炎球菌疫苗重要组分[46]。应用多肽-水平HDX-MS[44] 根据氘掺入fHbp有或无结合至12C1差分速率[differential rate]fHbp和细菌mAb 12C1间界面作图。在参比试验中鉴定19个多肽,构成fHbp序列的97%。图3中显示7/19fHbp多肽揭示与12C1结合的减低HDX率,与其氘摄取曲线。4个不连续片段包括三个N-端和一个C-端抗原表位片段被鉴定为潜在的抗原表位,和集聚在3D结构内不同区域中(3)。被HDX-MS鉴定的所有四个片段是存在于最终抗原表位位点被平行研究X-线晶体学证实[44]

 

3用氢/氘交换质谱(HDX-MS)抗原表位作图实例。图显示历时30 分钟标记在单抗(mAb)12C1的不存在()或存在()对因子H结合蛋白(fHbp)碎片氘摄取数据。在被显示的各碎片中mAb 12C1氘掺入减低。在HDX-MS分析中在fHbp结构中用红色突出被mAb 12C1保护的多肽。编号小球表示各受影响碎片段的开始或结束。经允许引自[44]

交换至蛋白复合物解释复杂化的其他因素[18]。在最简单情况中,抗体结合不对抗原诱导构象变化。但是,有时结合事件诱发远离抗原表位区域HDX中变化[47,48],一种来自变构效应的现象。在远离相互作用位点构象变化情况中,HDX数据的解释变得更复杂[49]。结合事件 可能还增强一个蛋白热力学稳定性,可能使蛋白复合物比游离蛋白总体更强保护免受HDX作用[50]。如图2中所示为鉴别在结合表面被保护引起减低HDX率与那些构象变化引起,一个实际方法 在生物制药行业是联合HDX-MS结果与计算分析和位点-指向突变发生。用HDX-MS用减低交换率鉴定的蛋白片段对结合提供宝贵的资料为指导随后计算对接预测分析。在HDX中不显示变化的区域往往可被排除,限制在对接研究可能涉及区域[43]。相反,HDX-MS实验数据也可用于验证区被硅片分析预测的抗原表位。例如,在Ca2+-无关磷脂酶A2被氟酮配体抑制研究中,HDX-MS实验显示在用计算分析预测抑制剂接触区氘的重要减低[51]。验证被鉴定的抗原表位进一步,位点-指向突变发生 – 单个丙氨酸突变或丙氨酸shaving突变发生[52,53] – 接着通过功能试验可被进行评价是否突变在结合或不结合抗原影响的氨基酸序列内。通过许多研究证实这个方法,例如Brier等,鉴定抑制剂靶向人类有丝分裂驱动蛋白Eg5的结合区[54]。通过在两个区进行突变发生显示在氘掺入率减低 – 环L5/螺旋α2 (Tyr125Glu145)和链β5/螺旋α3 (Ile202Leu227) –配体-结合位点被精确定位。与计算分析和靶向突变发生结合,HDX-MS提供一个有效迅速突径探查抗原表位,在特征化新颖生物药物提供宝贵资料对作用机制和结构-功能相互关系的了解。

可比性研究 

蛋白治疗药的开发和商业化中,进行可比性研究确保蛋白治疗药较高级结构的一致性和的结构动力学很重要[8]。各种降解途径经常针对未正确折叠的蛋白质,通常容易发生聚集和通过暴露的蛋白片段被免疫系统识别为外来的也可能引起免疫反应[55]。在蛋白治疗药中构象变化可能通过各种因子触发,例如在制造过程中,或贮存期间差异引起化学修饰,突变,表面结合,热或pH变性。虽然一级结构变化可通过常规LC/MS或串联MS (MS/MS)分析检测到,在某些情况下可能发生无蛋白质一级结构变化的构象变化。这类变化的研究需要可使用分析蛋白较高级结构的技术。在某些情况中,由于NMRX-射线晶体技术的复杂性和缺限,常规构象的生物药学分析和蛋白治疗药的稳定性典型地依赖经典的生物物理方法,例如圆二色性,FTIR广谱,热量测定法和大小排阻色谱法,是花费时间较短但只提供有限的,全面结构信息。HDX-MS已作为对较高级结构特征一种更信息方法,和它特别适于对可比性研究检测更细微的结构差异和提供关于蛋白段与非期望保护水平局部信息[5659]。这个方法被用作正交测量与在结构可比性研究为药物开发中其他生物物理技术在一起。下面描述两个实例,包括更高级结构评估和某种治疗性蛋白的动力学,粒细胞-集落-刺激因子(G-CSF)PEG[共价附着至聚乙二醇(PEG)][24]和一种用不同过程制造的全长的,糖基化治疗性mAb的可比性研究。治疗性蛋白质的聚乙二醇化是一种有效战略改进蛋白质药代动力学行为[60]。但是,它可能引起构象变化,空间干扰和对某些蛋白质静电结合性质变化[61,62]。在用G-CSF一项研究中[24],对PEG化和非PEGG-CSF型进行一种连续标记方法多肽HDX-MS实验。在两种蛋白质中均鉴定46中常见的多肽,组成线性序列覆盖G-CSF骨架的 91%,有多个区域存在重叠肽。对每个多肽得到历时一个时间跨度10 s4 h的氘摄取水平。发现在G-CSF的多个区域中氘标记小但可重现性差别;但是,对G-CSF序列65%PEG化氘掺入无可检测到的差异。一个胃酶解肽覆盖残基1932(一个α螺旋的部分),含受体结合涉及多个氨基酸,表明氘中无差别和对PEG化和非PEG化形式氘摄取保持低。总之,根据测得HDX差别的程度无重大蛋白构象变化发生。这项研究表明在HDX中观察到的变化,而方法统计显著,可能不显著影响G-CSF全局构象性质和生物活性,一个与其他研究一致的发现显示PEG化后 G-CSF保持其大多数生物活性[63]

在制造过程变化的结果蛋白治疗药可能发生构象变化。用HDX-MS可比性研究在全面和多肽水平进行比较来自三个不同制造过程的mAb样品(相同产品)。在纳米-UHPLC系统与Waters HDX技术,装备蛋白质标记自动化样品处理系统上进行HDX-MS实验(在一种连续标记方法)和淬灭,接着为多肽-水平分析通过在线胃蛋白酶消化[31]。用四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱仪进行质量测量。用DynamX1软件分析数据与另外原始光谱的手工核实。对全局HDX-MS分析,对所有三个mAb批被比较总体氘交换水平。采用如上所述相同实验装置但去除消化步骤。图4a中显示在10 s4 h时间跨度对每个mAb得到氘摄取水平和其相对氘摄取曲线。对个体标记时间点的平均相对标准差是小于5%,说明方法学的高度可重现性。在任何标记时间观察测得HDX水平无统计显著差别,表明三批mAb样品中没有全局构象差别。进行一个阳性对照实验比较一个用1.5 M盐酸胍处理1小时 mAb样品与未处理的相同mAb间氘摄取,如图4b所示。盐酸胍变性mAb,因此,蛋白变得更展开[非折叠unfolded]使得更多氘被掺入。所以,对处理样品氘摄取是较高于未处理样品,证实这个方法的灵敏度足够高分化这类全面构象变化。进行多肽-水平HDX-MS实验确保局部结构的一致性。在三个样品常用胃酶解肽被鉴定和对这些多肽每个检测氘摄取。图 4c 展示三个样品中对四个常被鉴定多肽的有些代表性氘摄取曲线。在所有常鉴定多肽进行这类比较分析,而在所有多肽氘摄取水平表明无显著差别超出三个被分析的样品的测量误差。在不同实验室位置/地点,由不同操作者HDX-MS平台 用不同的质谱仪和对蛋白质标记无自动化样品处理系统在相似类型的进行用相同批mAb样品相同可比性研究。被第二个实验室/地点观察到来自三个制造过程的三个抗体样品间氘掺入无差别在或完整或肽水平(数据未显示)。这个交叉-地点比较研究清楚地显示HDX-MS是一种健壮和可重现性方法。可比性研究的支持HDX-MS数据可被用于建立mAb样品较高级结构一致性。

4用氢/氘交换质谱(HDX-MS)可比性研究。(a) 全体-水平HDX-MS:对来自三个制造过程完整单克隆抗体(mAb)氘摄取曲线。 (b)-HCl(GndCl)-处理和-未处理mAb样品间在完整水平氘摄取曲线。(c) 多肽-水平HDX-MS:来自三个不同过程制造mAb4个代表性胃酶肽氘摄取曲线 – 顶部两肽来自mAb的轻链(LC)和底部两肽来自mAb的重链(HC)

结束语

如本综述所示中,对在蛋白治疗药发现中抗原表位作图和在产品发展中为可比性研究,HDX-MS是关键分析技术之一。随MS仪器增强的性能,分离科学中进展和在数据分析中软件发展,基于蛋白水解的HDX-MS实验甚至可能分析巨大蛋白质和蛋白复合物。利用电子转移解离(ETD)碎片化同时多肽-水平HDX-MS有潜能增强技术的空间分辨率,虽然在常规化前仍有几个障碍有待解决。偶联HDX-MS与计算模型分析和对接研究可能进一步整合这个技术至发现工作流程[64,65]。预计HDX-MS在评估蛋白治疗药较高级结构中将继续起重要作用。

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