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实验室常用技术参数资料(1)
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2013-5-24          ★★★【字体:

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实验室常用技术参数资料(1)

  一、核酸及蛋白质常用数据

1.核苷三磷酸的物理常数

化合物

分子量

λmax(pH7.0)

1摩尔溶液(pH7.0)中λmax时的最大吸收值

OD280/OD260

ATP

507

259

15400

0.15

CTP

483

271

9000

0.97

GTP

523

253

13700

0.66

UTP

484

262

10000

0.38

dATP

494

259

15200

0.15

dCTP

467

271

9300

0.98

dGTP

507

253

13700

0.66

dTTP

482

267

9600

0.71

2.常用核酸的长度与分子量

核酸

核苷酸数

分子量

λDNA

48502(双链环状)

3.0×107

pBR322

4363(双链)

2.8×106

28SrRNA

4800

1.6×106

23SrRNA

3700

1.2×106

18SrRNA

1900

6.1×105

19SrRNA

1700

5.5×105

5SrRNA

120

3.6×104

tRNA(大肠杆菌)

75

2.5×104

3.常用核酸蛋白换算数据

  (1)重量换算

  1μg=10-6g      1pg=10-12g

  1ng=10-9g      1fg=10-15g

  (2)分光光度换算:

  1A260双链DNA=50μg/ml

  1A260单链DNA=30μg/ml

  1A260单链RNA=40μg/ml

  (3DNA摩尔换算:

  1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端

  1μg pBR322 DNA=0.36pmol

  1pmol 1000bp DNA=0.66μg

  1pmol pBR322=2.8μg

  1kb双链DNA(钠盐)=6.6×105道尔顿

  1kb单链DNA(钠盐)=3.3×105道尔顿

  1kb单链RNA(钠盐)=3.4×105道尔顿

  (4)蛋白摩尔换算:

  100pmol分子量100000蛋白质=10μg

  100pmol分子量50000蛋白质=5μg

  100pmol分子量10000蛋白质=1μg

  氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿

  (5)蛋白质/DNA换算:

  1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质

  10000MW蛋白质=270bp DNA

  30000MW蛋白质=810bp DNA

  50000MW蛋白质=1.35kb

  100000MW蛋白质=2.7kb DNA

4.常用蛋白质分子量标准参照物

1)高分子量标准参照

2)中分子量标准参照

3)低分子量标准参照

肌球蛋白

分子量

磷酸化酶B

97400

碳酸酐酶

3100

肌球蛋白

212000

牛血清白蛋白

66200

大豆脻蛋白酶

21500

β-半乳糖甘酶B

116000

谷氨酶脱氢酶

55000

抑制剂

 

磷酸化酶B

97400

卵白蛋白

42700

马心肌球蛋白

16900

牛血清白蛋白

66200

醛缩酶

40000

溶菌酶

14400

过氧化氢酶`

57000

碳酸酐酶

31000

肌球蛋白(F1

8100

醛缩酶

40000

大豆脻蛋白酶

21500

肌球蛋白(F2

6200

 

 

抑制剂

 

肌球蛋白(F3

2500

 

 

溶菌酶

14400

 

 

5.常用DNA分子量标准参照物

λDNA/Hind

λDNA/EcoR

λ/Hind+EcoR

pBR322/Hae

23130

21226

21227

587

123

9416

7421

5148

405

104

6557

5804

4973

504

89

4361

5643

4268

458

80

2322

4843

3530

434

64

2027

3530

2027

267

57

564

 

1904

234

51

125

 

1584

213

21

 

 

1375

192

18

 

 

974

184

11

 

 

831

124

7

 

 

564

 

 

 

 

125

 

 

续上表

pBR322/Hinf

φχ174/Hinf

φχ174/Hae

φχ174/Tap

1631

726

140

1353

2914

517

713

118

1078

1175

506

553

100

872

404

396

500

82

603

327

344

417

66

310

231

298

413

48

281

141

221

311

42

271

87

220

249

40

234

54

154

200

24

194

33

75

151

 

118

20

 

 

 

72

 

  二、常用缓冲液

  1.分子克隆常用缓冲液

  2.磷酸缓冲液

  (125℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制

pH

1mol/L K2HPO4(ml)

1mol/L KH2PO4(ml)

5.8

8.5

91.5

6.0

13.2

86.8

6.2

19.2

80.8

6.4

27.8

72.2

6.6

38.1

61.9

6.8

49.7

50.3

7.0

61.5

38.5

7.2

71.7

28.3

7.4

80.2

19.8

7.6

86.6

13.4

7.8

90.8

9.2

8.0

94.0

6.2

  (225℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制

pH

1mol/L Na2HPO4(ml)

1mol/L NaH2PO4(ml)

5.8

7.9

92.1

6.0

12.0

88.0

6.2

17.8

82.2

6.4

25.5

74.5

6.6

35.2

64.8

6.8

46.3

53.7

7.0

57.7

42.3

7.2

68.4

31.6

7.4

77.4

22.6

7.6

84.5

15.5

7.8

89.6

10.4

8.0

93.2

6.8

  ※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml,根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值:

  pH=pK+1g([质子受体]/[质子供体])

  在此,pK=6.86(25)

  3.电泳缓冲液

  测序凝胶加样缓冲液

  98%去离子甲酰胺

  10mol/L EDTA(pH8.0)

  0.025%二甲苯青FF

  0.025%溴酚蓝

  甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色,则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用Whatman 1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液

使用液

浓贮存液(每升)

Tris-乙酸(TAE

1×:0.04mol/L Tris-乙酸

50×:242g Tris

 

0.001mol/L EDTA

57.1ml冰乙酸

 

 

100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

Tris-磷酸(TPE

1×:0.09mol/L Tris-磷酸

10×:10g Tris

 

0.002mol/L EDTA

15.5ml85%磷酸(1.679g/ml

 

 

40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

Tris-硼酸(TBEa

0.5×0.045mol/L Tris-硼酸

5×:54g Tris

 

0.001mol/L EDTA

27.5硼酸

 

 

20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

碱性缓冲液b

1×:50mmol/L NaOH

1×:5ml 10mol/L NaOH

 

1mmol/L EDTA

2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

Tris-甘氨酸c

1×:25mmol/L Tris

5×:15.1g Tris

 

250mmol/L 甘氨酸

94g 苷氨酸(电泳级)(pH8.3

 

0.1% SDS

50ml 10% SDS(电泳级)

  说明:

  ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。

  以片都以1×TBE作为使用液(即15稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以110稀释的贮存液作为使用液。

  进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

  ②碱性电泳缓冲液应现用现配。

  ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

  2×SDS凝胶加样缓冲液:

  100mmol/L Tris·HCl(6.8)

  200mmol/L二硫苏糖醇(DTT

  4%SDS(电泳级)

  0.2%溴酚蓝

  20%甘油

  不含DTT2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

  4.凝胶加样缓冲液

缓冲液类型

6×缓冲液

贮存温度


0.25%溴酚蓝


4

0.25%二甲苯青FF

40%W/V)蔗糖水溶液


0.25溴酚蓝


室温

0.25%二甲苯青FF

15%聚蔗糖(Ficoll400)


0.25%溴酚蓝


4

0.25%二甲苯青FF

30%甘油水溶液


0.25%溴酚蓝


4

40%(W/V)蔗糖水溶液

 

碱性加样缓冲液:

 

300mmol/L NaOH

6mmol/L EDTA


18%聚蔗糖(Ficoll400)


4

0.15%溴甲酚绿

0.25%二甲苯青FF

  使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

  选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

  5.各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制 

所需pH值(25℃)

0.1mol/L HCl的体积

71

457

72

447

73

434

74

420

75

403

76

385

77

366

78

345

79

320

80

292

8.1

26.2

8.2

22.9

8.3

19.9

8.4

17.2

8.5

14.7

8.6

12.4

8.7

10.3

8.8

8.5

8.9

7.0

  某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制:将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积(单位:ml)的0.1ml/L HCl混合,加水将体积调至100ml

  (2)温度对50mmol/L Tris·HClpH值的影响

4

25

37

81

75

72

82

76

73

83

77

74

84

78

75

85

79

76

86

80

77

87

81

78

88

82

79

89

83

80

90

84

81

91

85

82

92

86

83

93

87

84

94

88

85

  (6)常用缓冲液的pKa

缓冲液

分子量

pKa

缓冲范围

Trisa

12.1

8.08

7.17.9

HEPESb

283.3

7.47

7.28.2

MPOSc

209.3

7.15

6.67.8

PIPESd

304.3

6.76

6.27.3

MESe

195.2

6.09

5.46.8

  a:三羟甲基氨基甲烷;bN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磷酸;c3-N-吗啉代)丙磺酸;dNN-双(2-乙磺酸)哌嗪;e2-N-吗啉代)乙磺酸。

  7.温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系

pKa(20)

pKa/10

Mes

6.15

-0.110

Ada

6.60

-0.110

PiPes

6.80

-0.085

Aces

6.90

-0.200

Bes

7.15

-0.160

Mops

7.20

-0.013

Tes

7.50

-0.200

Hepes

7.55

-0.014

Tricine

8.15

-0.210

Tris

8.30

-0.310

Bicine

8.35

-0.180

Glycylglycine

8.40

-0.280

  三、常用酶的配制

  1.溶菌酶

  用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液,分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。

  2.蛋白水解酶类

 

贮存液

贮存温度

反应浓度

反应缓冲液

温度

预处理

 

0.01mol/L Tris(pH7.8)

 

链霉蛋白酶a

20mg/ml

-20℃(溶于水)

1mg/ml

0.01mol/L EDTA

37

自消化b

 

0.5% SDS

 

 

0.01mol/L Tris(pH7.8)

 

蛋白酶Kc

20mg/ml

-20℃(溶于水)

50μg/ml

0.005mol/L EDTA

3756

无须预处理

 

0.5% SDS

 

  a:链霉蛋白酶是从链球菌(Streptomyces griseus)中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

  b:自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染,经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下:把该酶的粉末溶解于10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)10mmol/l NaCl中,配成20mg/ml浓度,于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中,保存-20℃。

  c:蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,从林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)中纯化得到。该酶有两个Ca2+结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离,与催化机理并无直接关系。然而,如果从该酶中除去Ca2+,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以,蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA(以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白,如角蛋白一类,则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTpH8.0)至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+

  3.无DNA酶的RNA

  将胰RNA酶(RNAA)溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)15mmol/l NaCl中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。

 


 

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